Weryfikacja farmakopealnych metod analitycznych – co właściwie oznacza i kiedy ma zastosowanie?

Kiedy walidacja, a kiedy weryfikacja?
Farmakopea Europejska podaje, że w przypadku metod farmakopealnych, które są opisane w rozdziałach ogólnych ich zastosowanie, niezależnie od materiału badanego powinno zostać poprzedzone walidacją, której przeprowadzenie leży po stronie użytkownika. Inaczej jest w przypadku farmakopealnych metod analitycznych, które jeżeli są przywołane w indywidualnej monografii, zostały już zwalidowane zgodnie z obowiązującymi zasadami walidacji metod analitycznych. O ile w monografii nie podano inaczej, dla takich procedur nie jest wymagane przeprowadzenie pełnej walidacji, a jedynie weryfikacja, czyli jednorazowa ocena przydatności metody, przed jej zastosowaniem w danym laboratorium. Do tej pory całkowicie na użytkowniku spoczywała odpowiedzialność ustalenia czy i w jaki sposób powinien on zweryfikować przydatność takiej metody farmakopealnej. Na szczęście Komisja Farmakopei Europejskiej wychodząc naprzeciw rozterkom wielu użytkowników, w części podstawowej jedenastego wydania Ph.Eur. opublikowała nowy rozdział ogólny 5.26 Implementation of pharmacopoeial procedures. Rozdział ten ma charakter informacyjny i może znacznie ułatwić proces implementacji procedur. Zanim jednak przejdzie się do wdrożenia metody farmakopealnej, warto zapoznać się z wytycznymi obowiązującymi dla pełnej walidacji metod.

Walidacja procedur analitycznych
Jest to proces ciągły monitorowania procedury, który ma za zadanie zapewnić, że badania wykonywane są zgodnie z oczekiwaniami, a w razie konieczności zostanie przeprowadzona rewalidacja metody. Walidację procedur analitycznych prowadzi się w oparciu o wytyczne Międzynarodowej Konferencji ds. Harmonizacji (ICH), która w celu ujednolicenia zasad walidacji metod opracowała normę ICH Q2(R1). Wyróżnia się cztery podstawowe rodzaje procedur analitycznych: testy identyfikacyjne, badania ilościowe zawartości zanieczyszczeń, badania graniczne kontroli zanieczyszczeń tzw. limit testy oraz badania zawartości lub siły działania. Każdą z wyżej wymienionych rodzajów metod opisuje się za pomocą parametrów walidacyjnych, takich jak na przykład specyficzność, dokładność, liniowość, zakres, granica wykrywalności, granica oznaczalności, precyzja, czy odporność.

Ważnym etapem przed rozpoczęciem walidacji jest określenie charakterystycznych cech metody analitycznej oraz ustalenie odpowiednich kryteriów akceptacji dla wybranych parametrów walidacyjnych. Do najważniejszych cech metody, które pomogą ją właściwie zoptymalizować i zwalidować należą: charakter metody (ilościowa czy jakościowa), rodzaj oznaczanego analitu, jego poziom lub zakres stężeń, wymagana dokładność, rodzaj matrycy, obecność substancji interferujących, a także wymagania sprzętowe. Kryteria akceptacji ustala się w warunkach własnego laboratorium, na podstawie wytycznych oraz własnego doświadczenia wynikającego z optymalizacji metody.

Każdy proces walidacji powinien zakończyć się opracowaniem raportu zawierającego szczegółowy opis przeprowadzonych działań wraz z omówieniem zastosowanych procedur statystycznych do oceny otrzymanych wyników. Bardzo ważnym elementem raportu jest podsumowanie zawierające wnioski oraz podanie wskaźników, które należy monitorować w celu zapewnienia, że metoda pozostaje zwalidowana, a otrzymany wynik nadal jest prawidłowy.

Ocena wdrożenia procedury farmakopealnej
Jeżeli procedura analityczna nie wymaga pełnej walidacji, należy przeprowadzić ocenę przydatności metody w rzeczywistych warunkach stosowania. Dobrą praktyką jest, aby taką ocenę poprzedzała analiza ryzyka określająca zakres przeprowadzanej oceny. Potwierdzają to również zapisy nowego rozdziału ogólnego Ph.Eur. 5.26 mówiące o tym, że w pierwszej kolejności użytkownik powinien wykonać ocenę procesu wdrożenia procedury analitycznej. Ocena ma na celu ustalenie, czy istnieją jakieś czynniki krytyczne związane z rzeczywistymi warunkami jej stosowania w laboratorium, które mogą mieć wpływ na poprawność wykonywanej procedury i powinna obejmować:

• skład badanego produktu,
• przygotowanie próbki,
• odczynniki stosowane do przeprowadzenia procedury,
• sprzęt laboratoryjny potrzebny do przeprowadzenia procedury,
• środowisko laboratoryjne.

Gdy nie zostanie wykryty żaden czynnik krytyczny, metoda może być stosowana w laboratorium bez konieczności dodatkowej weryfikacji w rzeczywistych warunkach stosowania. Jeżeli w wyniku przeprowadzonej oceny zostaną wykryte jakieś czynniki krytyczne mogące mieć wpływ na prawidłowość otrzymywanych wyników, użytkownik powinien przeprowadzić odpowiednie eksperymenty weryfikujące.

Ocena przydatności procedury farmakopealnej
Punktem wyjścia wyboru parametrów do weryfikacji zawsze powinny być parametry wymagane podczas pełnej walidacji danej metody. W Farmakopei Europejskiej zdefiniowano ogólny plan weryfikacji procedury (Tab.2), który należy każdorazowo dostosować do własnego zamierzonego zastosowania metody. W niektórych przypadkach, do weryfikacji mogą posłużyć opisane w monografiach indywidualnych lub rozdziałach ogólnych testy, przeznaczone do sprawdzenia przydatności procedur analitycznych. Plan weryfikacji powinien obejmować także kryteria akceptacji ustalone przez użytkownika.

Parametry oceniające wydajność procedury analitycznej (APPCs)
Jednym z najważniejszych parametrów charakteryzujących metodę jest precyzja, która wyraża stopień zgodności pomiarów uzyskanych w wyniku kilkukrotnego pobrania próbek tej samej jednorodnej próbki, w określonych warunkach. Precyzję rozpatruje się przeważnie na dwóch poziomach, sprawdzając powtarzalność metody oraz precyzję pośrednią. Powtarzalność wyraża zgodność wyników pomiarów uzyskanych przez jednego analityka, w najkrótszym możliwym czasie, przy użyciu tych samych odczynników i sprzętu. Precyzja pośrednia odnosi się do powtarzalności w obrębie laboratorium i wyraża zgodność wyników uzyskanych przez różnych analityków, w różne dni, na różnym sprzęcie i odczynnikach. Precyzję definiują statystycznie wartość średniej, odchylenie standardowe, wariancja, przedział ufności oraz współczynnik zmienności. Jeżeli podczas oceny procesu wdrożenia zostanie ustalone, że na precyzję raczej nie będą wpływały zmiany dnia, analityka czy sprzętu wówczas podczas weryfikacji metody nie jest konieczne sprawdzenie precyzji pośredniej.

Ocena dokładności dotyczy głównie ilościowych metod badania zwartości, siły działania, rozpuszczania oraz właściwości fizykochemicznych. Wyraża stopień zgodności uzyskanych wyników z wartością prawdziwą uzyskaną inną metodą referencyjną. Dokładność dostarcza informacji o błędach systematycznych metody i może być oceniona poprzez porównanie weryfikowanej procedury z inną metodą, której dokładność uznajemy za wzorcową lub poprzez zbadanie prób modelowych na trzech poziomach zawartości deklarowanej w produkcie (80%, 100%, 120%) i ocenie procentu odzysku substancji oznaczanej. W przypadku pierwszego sposobu dokładność jest potwierdzana za pomocą testów istotności, jak na przykład test t-Studenta, który powinien wykazać brak istotnej różnicy pomiędzy wynikami otrzymanymi obiema metodami. W przypadku drugiego sposobu, po przeprowadzeniu analizy statystycznej dokładność metody uznaje się za odpowiednią, gdy procent odzysku jest bliski 100, a otrzymane wyniki mieszą się w przedziale 98%-102%. Jeżeli przedział uzyskanych wyników jest szerszy, związek pomiędzy wartością otrzymaną a wartością prawdziwą można zmierzyć graficznie za pomocą krzywej regresji.

Ocena specyficzności metody może być konieczna zarówno dla metod jakościowych (np. badanie tożsamości), jak i dla metod ilościowych. Procedura analityczna powinna umożliwiać zbadanie analitu w obecności wszystkich substancji pomocniczych występujących w próbce. Jednocześnie otrzymany wynik nie powinien powtórzyć się w próbce pozbawionej substancji oznaczanej. Specyficzność potwierdza się na podstawie próbek zdefiniowanych, jako prawdziwie pozytywne oraz prawdziwie negatywne.

Weryfikacja zakresu polega na potwierdzeniu przedziału pomiędzy najwyższym a najniższym stężeniem substancji badanej w próbce, dla którego oznaczenie wykonywane jest z zachowaniem odpowiedniej precyzji, dokładności i liniowości metody. W związku z tym, do wyznaczenia zakresu konieczne jest przeprowadzenie testów liniowości, dokładności, precyzji oraz granicy oznaczalności.

Poprzez ocenę czułości w planie weryfikacji metody farmakopealnej rozumie się sprawdzenie dolnej granicy zakresu procedury analitycznej. Weryfikacja tego parametru dotyczy przede wszystkim badań zanieczyszczeń i jest możliwa, gdy granica wykrywalności oraz granica oznaczalności zostały określone podczas pierwotnej walidacji metody farmakopealnej.

Liniowość, tak jak w przypadku dokładności, dotyczy głównie ilościowych metod badania zwartości, siły działania, rozpuszczania oraz właściwości fizykochemicznych i oznacza, że wyniki uzyskane w danym zakresie są wprost proporcjonalne do ilości substancji oznaczanej w próbce. Ocenę tego parametru przedstawia się poprzez analizę regresji, wyznaczając krzywą regresji na podstawie minimum trzech oznaczeń, dla co najmniej 5 stężeń analitu mieszczących się w oczekiwanym zakresie. Wszystkie zmierzone wartości powinny być rozłożone na krzywej regresji lub po obu jej stronach, a obliczony współczynnik korelacji powinien być jak najbliższy wartości 1.

Miarą zdolności metody do pozostania stabilną w warunkach niewielkich zmian parametrów, takich jak na przykład serie odczynników, zmiany temperatury otoczenia czy wydłużenie czasu inkubacji jest ocena odporności. Dzięki sprawdzeniu odporności pozyskuje się istotne informacje na temat krytycznych etapów metody oraz można ustalić dopuszczalne zmiany, których wystąpienie nie będzie miało wpływu na poprawność otrzymanego wyniku. Podczas analizy statystycznej wyników oblicza się odchylenie standardowe, względne odchylenie standardowe oraz przedział ufności wartości średniej otrzymanych wyników. Rezultatem weryfikacji jest określenie stopnia zgodności pomiędzy wynikami pomiarów uzyskanych dla zmienionych warunków badania.

Podsumowanie
Analizując dostępne wytyczne oraz wskazówki dotyczące implementacji procedur farmakopealnych, może się okazać, że w niektórych przypadkach weryfikacja metody będzie tak naprawdę pełną walidacją. To użytkownik ponosi odpowiedzialność za wybór odpowiedniej techniki wdrożenia metody, biorąc pod uwagę możliwości swojego laboratorium, kompetencje personelu oraz stosowane technologie. Ostateczna ocena procesu wdrożenia metody analitycznej jest przeprowadzana przez właściwy organ kontrolujący, a wynik oceny zależy od wykazania przez użytkownika pełnej dokumentacji potwierdzającej słuszność swojego wyboru. Jedno jest pewne, niezależnie od tego, czy metoda zostanie poddana pełnej walidacji, czy weryfikacji przeprowadzony proces powinien dostarczyć dowodów, że podczas każdego wykonania procedury analitycznej pozostanie ona niezawodna, a otrzymane wyniki będą wiarygodne.

Artykuł ukazał się w kwartalniku "Świat Przemysłu Farmaceutycznego" 4/2023