Test aktywacji monocytów (MAT) jako standard oceny pirogenności – co muszą wiedzieć firmy farmaceutyczne

Zmiana, która dotknie całą branżę

Pirogen to każda substancja, która po wprowadzeniu do organizmu wywołuje gorączkę poprzez aktywację układu odpornościowego. Najczęściej są to substancje pochodzenia biologicznego, w tym: endotoksyny bakteryjne (lipopolisacharydy, LPS) – pochodzące głównie z bakterii Gram-ujemnych. Wyróżniamy jednak również pirogeny nieendotoksyczne w tym wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP, ang. pathogen-associated molecular patterns) – białka lub fragmenty komórkowe bakterii Gram-dodatnich, grzybów, wirusów, a także fragmenty kwasów nukleinowych (DNA, RNA), biologiczne i chemiczne zanieczyszczenia oraz pochodne związane z produktem i procesem produkcyjnym. Rzadziej pirogeny mogą mieć pochodzenie chemiczne, np. mogą pochodzić ze składników materiałowych opakowań lub wyrobów medycznych – określa się je wtedy jako pirogeny materiałozależne (material-mediated pyrogens). Produkty parenteralne i implanty muszą być wolne od pirogenów – to warunek dopuszczenia ich do obrotu. Nawet śladowe ilości mogą prowadzić do gorączki, wstrząsu septycznego, a w skrajnych przypadkach – do zgonu.

Najsilniejszymi pirogenami są endotoksyny pochodzące z bakterii Gram-ujemnych.
Pozostałe pirogeny określane są jako nieendotoksynowe pirogeny (NEP non-endotoxin pyrogens). Celem testu pirogenności jest wykazanie, że poziom pirogenów w produkcie nie przekracza dopuszczalnego limitu (contaminant limit concentration CLC). Dostępne testy pirogenności to test na królikach (Rabbit Pyrogen Test RPT) (Ph. Eur. 2.6.8), polegający na ocenie wzrostu temperatury po podaniu preparatu. Test RPT jest testem in vivo i zostanie wycofany w styczniu 2026 roku oraz zastąpiony testem aktywacji monocytów (Monocyte Activation Test MAT Ph. Eur. 2.6.30, USP <1085>), który jest testem in vitro wykrywającym zarówno endotoksyny, jak i NEP. Inne testy in vitro do pomiaru endotoksyn to test rFC — rekombinowany czynnik C (Ph. Eur. 2.6.32) oraz LAL Limulus amebocyte lysate — klasyczny test z działający z wykorzystaniem lizatu krwi skrzypłoczy zwany inaczej bakteryjnym testem endotoksyn (Bacterial Endotoxin Test BET Ph. Eur. 2.6.14) również specyficzny tylko dla endotoksyn. BET/LAL jest powszechnie stosowany do badania bezpieczeństwa produktów farmaceutycznych, wyrobów medycznych i innych próbek pod kątem skażenia endotoksynami, ponieważ lizat z krwi skrzypłocza reaguje z nimi, tworząc widoczny skrzep lub zmianę koloru, co pozwala na zidentyfikowanie i zmierzenie ich ilości. MAT jest jedynym rutynowo stosowanym testem zdolnym do wykrywania zarówno endotoksyn, jak i NEP. Ponieważ opiera się na reakcji komórek ludzkiego układu odpornościowego, uznaje się go za metodę najbliżej odzwierciedlającą rzeczywistą odpowiedź immunologiczną człowieka. Test aktywacji monocytów został zwalidowany przez Europejskie Centrum ds. Walidacji Alternatywnych Metod (European Centre for the Validation of Alternative Methods ECVAM, 2005) oraz Międzyagencyjny Komitet Koordynujący ds. Walidacji Alternatywnych Metod (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods ICCVAM, 2008). W Farmakopei Europejskiej jest metodą kompendialną i może zastąpić test na królikach po walidacji właściwej dla produktu.

Przez dekady podstawą oceny pirogenności był test wykorzystujący króliki RPT, a od lat 70. – test endotoksyn bakteryjnych BET/LAL dla LPS. Istnieje wiele przyczyn, które doprowadziły jednak do przełomu: od 1 stycznia 2026 r. RPT zostaje usunięty z Farmakopei Europejskiej. Jedną z przyczyn są postępy w nauce oraz postanowienia Europejskiej Konwencji o ochronie zwierząt kręgowych wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych. Badania muszą być przeprowadzane w taki sposób, aby wykorzystać minimalną liczbę zwierząt oraz powodować jak najmniejszy ból, cierpienie, stres lub trwałe uszkodzenia u zwierząt. W miarę możliwości oraz po walidacji specyficznej dla danego produktu, test pirogenności zastępuje się alternatywną metodą in vitro MAT. W artykule wyjaśniam konsekwencje, sposób wdrożenia MAT zgodnie z wymaganiami regulacyjnymi i praktyczne korzyści dla wytwórców leków oraz wyrobów medycznych.

Regulacyjne podstawy zmian:

• Ph. Eur. 2.6.8 (Pyrogens) – wycofanie RPT od 01.01.2026.
• Ph. Eur. 2.6.30 (Monocyte Activation Test) – metoda z wyboru dla pirogenów, w tym NEP.
• Ph. Eur. 5.1.10 – ocena ryzyka NEP i praktyczna weryfikacja ryzyka.
• USP: MAT opisany jako równoważna alternatywa wobec RPT; globalny trend ograniczania metod in vivo.
• Variations Regulation (EC) No 1234/2008 – zmiana metody badania w module 3 CTD co do zasady = variation typu II (istotna), wymagająca walidacji.

Dlaczego badamy pirogeny? – cel testów pirogenności

Jak już wcześniej wspomniano produkty lecznicze podawane pozajelitowo mogą powodować działania niepożądane wynikające z potencjalnego zanieczyszczenia substancjami pirogennymi (zanieczyszczeniami drobnoustrojowymi, zanieczyszczeniami powstałymi w procesie wytwarzania) lub z ich własnej aktywności prozapalnej, w tym pirogenności, której skutki mogą obejmować od gorączki aż po objawy wstrząsopodobne zagrażające życiu. Celem badań pirogenności jest ograniczenie do akceptowalnego poziomu ryzyka wystąpienia reakcji gorączkowej u pacjenta po podaniu danego produktu. Badanie pirogenów jest więc kluczowym elementem kontroli jakości produktów leczniczych i wyrobów medycznych mających kontakt z krwią lub płynami ustrojowymi. Zgodnie z przepisami Farmakopei Europejskiej, USP i wytycznymi EMA, wszystkie produkty parenteralne i implanty muszą być wolne od pirogenów. Kontrola pirogenności wyżej wymienionych jest konieczna dla dopuszczenia produktu do obrotu. Ponieważ nawet niewielkie ilości endotoksyn mogą wywołać gwałtowną reakcję zapalną, wczesne wykrywanie pirogenów pozwala zapobiegać poważnym incydentom medycznym czyuniknąć sytuacji wycofania produktu z rynku lub niedopuszczenia produktu do obrotu.

Endotoksyny pochodzące od bakterii Gram-ujemnych są najczęstszą przyczyną reakcji pirogennych wywołanych przez zanieczyszczone produkty farmaceutyczne. Aktywność pirogenna endotoksyn (lipopolisacharydów) jest znacznie wyższa niż innych znanych substancji pirogennych. Poziom endotoksyn bakteryjnych weryfikuje się metodami opisanymi w ogólnych monografiach 2.6.14. Endotoksyny bakteryjne lub 2.6.32. Badanie endotoksyn bakteryjnych z użyciem rekombinowanego czynnika C.

Pirogenów jednak nie można wykryć przy użyciu testu na endotoksyny bakteryjne. Potencjalnymi źródłami pirogenów nieendotoksynowych są m.in. bakterie Gram-dodatnie, grzyby, wirusy oraz cząstki stałe. Takie substancje pirogenne mogą zostać wykryte metodami opisanymi w ogólnej monografii 2.6.30. Test aktywacji monocytów umożliwia wykrycie zarówno pirogenów endotoksynowych, jak i nieendotoksynowych.

Endotoksyny bakteryjne pochodzące od bakterii Gram-ujemnych są najczęstszymi i najbardziej aktywnymi egzogennymi pirogenami. Dlatego testy na endotoksyny bakteryjne opisane w ogólnych monografiach 2.6.14 i 2.6.32 są najpowszechniej stosowanymi metodami analitycznymi do oceny pirogenności produktów leczniczych podawanych pozajelitowo oraz ich składników. Podejście to jest jednak właściwe wyłącznie wówczas, gdy można wykluczyć obecność pirogenów nieendotoksynowych.

Aby wykluczyć obecność pirogenów nieendotoksynowych w substancjach lub produktach, zaleca się przeprowadzenie testu aktywacji monocytów (2.6.30) podczas opracowywania procesu wytwarzania; w przypadku jakichkolwiek zmian w procesie, które mogłyby wpłynąć na jakość produktu w zakresie pirogenności, zaleca się ponowne wykonanie testu aktywacji monocytów. Przykłady takich zmian obejmują zastosowanie innych surowców, zmianę miejsca produkcji lub zmianę parametrów procesu. Test aktywacji monocytów należy stosować dla wszystkich produktów przeznaczonych do podawania pozajelitowego, jeśli nie można wykluczyć obecności pirogenów nieendotoksynowych.

Metody opisane w ogólnych monografiach 2.6.14. Endotoksyny bakteryjne, 2.6.30. Test aktywacji monocytów oraz 2.6.32. Badanie endotoksyn bakteryjnych z użyciem rekombinowanego czynnika C zostały zwalidowane zgodnie z przyjętą praktyką naukową oraz aktualnymi zaleceniami dotyczącymi walidacji metod analitycznych. W związku z tym nie wymagają one ponownej walidacji jako takiej, poza przypadkami dostosowania do konkretnej substancji lub produktu w określonym środowisku analitycznym.

Decyzja o zastosowaniu testu na endotoksyny bakteryjne jako jedynego testu pirogenności powinna zostać podjęta po ocenie ryzyka wystąpienia pirogenów nieendotoksynowych w danej substancji lub produkcie. Ocena ryzyka powinna być powtarzana w przypadku istotnych zmian parametrów procesu, ponieważ nie można wykluczyć potencjalnego zanieczyszczenia pirogenami nieendotoksynowymi.

W celu wsparcia oceny ryzyka zaleca się wykonanie doświadczeń z użyciem testu aktywacji monocytów równolegle z badaniami walidacyjnymi testu na endotoksyny bakteryjne, wykorzystując te same serie produktu. Wskazówki dotyczące wyboru metody (1 lub 2) oraz walidacji testu aktywacji monocytów zawarte są w ogólnej monografii 2.6.30. Test aktywacji monocytów.

Ocena ryzyka powinna uwzględniać wszystkie czynniki, które mogą prowadzić do obecności pirogenów niewykrywanych testem na endotoksyny bakteryjne.

Ocena ryzyka w procesie wytwarzania produktów leczniczych wymaga uwzględnienia szeregu czynników, które mogą wpływać na bezpieczeństwo i jakość końcowego produktu. Jednym z kluczowych aspektów jest charakter procesu wytwarzania. W zależności od tego, czy substancja czynna powstaje w wyniku syntezy chemicznej, fermentacji czy metod biotechnologicznych, należy przeanalizować różne źródła potencjalnych zagrożeń. W przypadku produktów fermentacyjnych szczególnie istotne jest określenie typu systemu ekspresyjnego – prokariotycznego lub eukariotycznego – ponieważ może on determinować rodzaj i poziom zanieczyszczeń. W systemach prokariotycznych warto dodatkowo zwrócić uwagę na to, czy wykorzystywane są bakterie Gram-dodatnie czy Gram-ujemne, gdyż różnią się one obecnością ściany komórkowej i potencjałem do wytwarzania endotoksyn. Równie ważna jest analiza składu podłoża hodowlanego, z uwzględnieniem pochodzenia poszczególnych składników – syntetycznych, zwierzęcych lub roślinnych – co może mieć znaczenie dla bezpieczeństwa mikrobiologicznego i dla potencjału alergennego produktu.

Drugim istotnym elementem oceny ryzyka jest zanieczyszczenie mikrobiologiczne (bioburden). Należy uwzględnić możliwość obecności bakterii Gram-dodatnich oraz grzybów jako potencjalnych zanieczyszczeń substancji czynnej, substancji pomocniczych lub surowców wykorzystywanych w produkcji. Szczególne znaczenie ma pochodzenie tych surowców – syntetyczne, zwierzęce czy roślinne – ponieważ wpływa ono na ryzyko wprowadzenia mikroorganizmów do procesu. Ważnym czynnikiem jest również jakość wody stosowanej w produkcji, która może być istotnym źródłem kontaminacji. Jednym z podstawowych źródeł NEP jest środowisko ogólne, w tym powietrze i kurz, które mogą zawierać zanieczyszczenia organiczne oraz produkty metabolizmu mikroorganizmów. Równie istotnym czynnikiem są komponenty opakowań, zwłaszcza te mające bezpośredni kontakt z produktem – szkło, tworzywa sztuczne czy gumowe uszczelki mogą wprowadzać do produktu substancje o działaniu pirogennym, jeśli nie zostaną odpowiednio oczyszczone lub wyjałowione.

Kolejnym potencjalnym źródłem są surowce wykorzystywane w procesie wytwarzania, zarówno pochodzenia syntetycznego, jak i naturalnego. Surowce roślinne, zwierzęce czy mikrobiologiczne mogą zawierać składniki biologicznie aktywne, które działają pirogennie. Materiały wprowadzane do pomieszczeń czystych, takie jak odzież ochronna, narzędzia czy sprzęt pomocniczy, również stanowią istotne źródło ryzyka, jeśli nie są właściwie kontrolowane i dekontaminowane. Nie można pominąć bakterii skóry personelu, które mogą wydzielać egzotoksyny lub inne substancje o działaniu pirogennym. Podobne zagrożenie stwarza osocze ludzkie lub zwierzęce, stosowane w niektórych procesach biotechnologicznych – jego składniki białkowe mogą indukować reakcje gorączkowe.

Ostatnim, lecz nie mniej istotnym źródłem są systemy wentylacyjne i filtracyjne powietrza. Niewłaściwie utrzymane filtry lub kanały wentylacyjne mogą stać się rezerwuarem cząstek organicznych i mikroorganizmów, które następnie przedostają się do pomieszczeń czystych, zwiększając ryzyko kontaminacji pirogennej. Ocena powinna opierać się na danych z monitoringu mikrobiologicznego oraz zapisach serii produktu.

Kolejnym aspektem jest zdolność procesu oczyszczania, czyli skuteczność etapów technologicznych w usuwaniu zanieczyszczeń, w tym substancji pirogennych. Urządzenia używane do wytwarzania produktu, w tym zbiorniki, mieszalniki i przewody, mogą być źródłem NEP w przypadku niewłaściwego mycia, dezynfekcji lub konserwacji. Procesy te muszą być odpowiednio zaplanowane i udokumentowane, aby zapewnić bezpieczeństwo końcowego produktu leczniczego.

Ostatnim, lecz równie ważnym czynnikiem, jest bezpieczeństwo stosowania produktu, które należy analizować w kontekście populacji docelowej oraz drogi podania. Produkty przeznaczone do podania dożylnego czy dokanałowego wymagają szczególnie rygorystycznej oceny czystości mikrobiologicznej i pirogenności, ponieważ nawet śladowe ilości zanieczyszczeń mogą stanowić zagrożenie dla pacjenta.

Całościowa ocena ryzyka powinna zatem integrować wszystkie wymienione elementy, umożliwiając identyfikację i minimalizację potencjalnych zagrożeń na każdym etapie procesu wytwarzania.

Coraz więcej badań wskazuje, że w sytuacji, gdy w leku obecne są zarówno endotoksyny, jak i pirogeny niebędące endotoksynami, może dojść do efektu synergistycznego lub potencjalnego wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej, co stanowi poważne ryzyko dla pacjenta. Przykładowo zanieczyszczenie wyłącznie LPS (endotoksyną) powodowałoby wydzielanie 75 pg/ml IL-6, zanieczyszczenie wyłącznie R848 (pirogenem niebędącym endotoksyną) – 50 pg/ml IL-6, jednak ich jednoczesna obecność mogłaby wywołać stężenie IL-6 na poziomie 300 pg/ml, zamiast oczekiwanej sumy 75 + 50 = 125 pg/ml. Taki efekt synergii zwiększa ryzyko nadmiernej reakcji immunologicznej i stanowi istotny czynnik ryzyka dla bezpieczeństwa pacjentów.

Test Pirogenności na Królikach (RPT)

Na terenie Europy test RPT jest dostępny wyłącznie w sytuacjach, gdy nie istnieje odpowiednia metoda alternatywna niewykorzystująca zwierząt, a jego stosowanie zostało zatwierdzone przez Europejską Agencję Leków (EMA). RPT polega na dożylnym wstrzyknięciu próbki produktu biologicznego królikom i monitorowaniu ich temperatury przez kilka godzin. Istotny wzrost temperatury świadczy o obecności pirogenów. Wszystkie testy RPT przeprowadzane są z wykorzystaniem królików SPF (Specific Pathogen-Free) i zgodnie z obowiązującymi standardami farmakopealnymi.

Wraz ze wzrostem globalnej świadomości w zakresie etyki wykorzystywania zwierząt do testów pirogenności, producenci farmaceutyczni poszukiwali metod in vitro, które całkowicie wyeliminują konieczność stosowania zwierząt w badaniach QC.

Dodatkowo wzrosło zapotrzebowanie na testy wykrywające NEP. Tradycyjne metody oparte na testach zwierzęcych mają ograniczenia szczególnie w przypadku złożonych formulacji i procesów wytwarzania leków biologicznych, takich jak szczepionki czy terapie komórkowe i genowe a także wytwarzania wyrobów medycznych.

Test Aktywacji Monocytów (MAT) – zasada i kluczowe elementy

MAT to zaawansowana metoda badania pirogenności in vitro, w której wykorzystywana jest kriokonserwowana krew ludzka, PBMC (mononuklearne komórki krwi obwodowej), lub linie komórkowe THP-1, MonoMac-6 jako źródło monocytów.

Test dzieli się na dwa etapy. W pierwszym etapie monocyty inkubuje się ze standardami endotoksyn, próbkami kontrolnymi oraz badanymi próbkami. Jeśli w próbce obecne są substancje pirogenne, monocyty uwalniają cytokiny prozapalne, takie jak czynnik martwicy nowotworów (TNF-α), interleukina 1 (IL-1β) lub interleukina 6 (IL-6). W drugim etapie cytokiny te są wykrywane przy użyciu testu ELISA na płytce mikrotitracyjnej przy użyciu swoistych przeciwciał i reakcji kolorymetrycznej, a wyniki wyrażane są w jednostkach równoważnych endotoksynie na mililitr (EEU/mL).

MAT wykrywa szersze spektrum pirogenów w porównaniu z tradycyjnymi metodami, obejmując zarówno endotoksyny, jak i pirogeny nieendotoksyczne (NEP). Dzięki temu jest szczególnie cennym narzędziem w badaniu leków biologicznych i złożonych produktów farmaceutycznych. Ponadto, ze względu na ludzkie pochodzenie materiału używanego do przeprowadzenia badania, metoda ta charakteryzuje się wyższą czułością i wiarygodnością w przypadku zaawansowanych terapii biologicznych.

Proces wdrożenia metody rozpoczyna się od potwierdzenia, że MAT jest odpowiednią metodą badawczą dla danego produktu. Dla każdego produktu trzeba przeprowadzić walidację testu. W tym celu przeprowadza się badania czynników zakłócających badanie (interference factor testing), które polegają na ocenie, czy procent odzysku (recovery) produktu wzbogaconego o znane stężenie endotoksyn lub pirogenów nieendotoksycznych mieści się w zakresie wymaganym przez Ph.Eur (50–200%). Następnie realizowane są badania przedwalidacyjne oraz walidacje specyficzne dla produktu, prowadzone zgodnie z wytycznymi Ph.Eur. Odzysk endotoksyn (endotoxin recovery) jest mierzony, aby wykluczyć możliwe interferencje pomiędzy testem MAT a badanym produktem. Celem jest wyeliminowanie ryzyka związanego z obecnością zamaskowanych pirogenów, które w danym momencie są nieaktywne i niewykrywalne, lecz mogą ponownie ulec aktywacji po podaniu do organizmu człowieka. W tym celu próbka produktu jest doszczepiana określoną ilością endotoksyny (tzw. „spike”), po czym mierzy się jej zawartość za pomocą testu MAT. Efekt maskowania endotoksyn występuje wtedy, gdy zmierzona ilość endotoksyny jest niższa niż 50% ilości dodanej. Może to wynikać z: interferencji pomiędzy monocytami a badaną próbką, prowadzących do braku wydzielania interleukiny-6 (IL-6), lub z tego, że badana substancja wiąże IL-6, przez co nie może być wykryta w teście ELISA. Nie wiadomo dokładnie, jak powstają te interferencje, ale mogą one zafałszować wynik testu. Jeśli dodana ilość pirogenu nie może zostać prawidłowo oznaczona, to również pirogreny już obecne w produkcie mogą wpływać na wynik, co uniemożliwia wiarygodną ocenę zanieczyszczenia. W takim przypadku seria nie może zostać dopuszczona do obrotu. Jak można przezwyciężyć efekt maskowania? Jednym z rozwiązań jest rozcieńczenie próbki do poziomu, który nadal mieści się poniżej maksymalnego zwalidowanego rozcieńczenia (maximum validated dilution MVD), z nadzieją, że interferencje nie wystąpią. MVD można obliczyć, dzieląc CLC (contaminant limit concentration), czyli dopuszczalne stężenie zanieczyszczenia, przez LoD (limit of detection), czyli granice oznaczalności. Jest to istotny parametr testu aktywacji monocytów, szczególnie wtedy, gdy badane produkty farmaceutyczne wymagają dużego rozcieńczenia (wysokiego MVD) w celu ograniczenia możliwego wpływu matrycy próbki na wynik testu, lub gdy mają niską dopuszczalną zawartość zanieczyszczeń (niski CLC). Testy MAT o niskiej wartości LoD pozwalają na uzyskanie wyższego MVD, a tym samym poszerzają zakres produktów farmaceutycznych, które można w ten sposób badać.

Wybór komórek do badań

W testach aktywacji monocytów (MAT) mierzona jest reakcja ludzkiego wrodzonego układu odpornościowego na obecność pirogenów. W teście wykorzystuje się ludzkie monocyty, czyli kluczowe komórki odporności wrodzonej, które w reakcji na obecność endotoksyn lub pirogenów nieendotoksycznych wydzielają prozapalne cytokiny, takie jak interleukina-6 (IL-6), związane z występowaniem gorączki u ludzi. Monocyty CD14+ stanowią podgrupę komórek układu odpornościowego człowieka. Są one wyspecjalizowanymi „detektorami” pirogenów i odgrywają kluczową rolę w gorączkowej reakcji organizmu. Grupa białek powierzchniowych komórek, tzw. receptory Toll-podobne (Toll-Like Receptors, TLR), to receptory rozpoznające wzorce patogenów (PRR), które są szeroko ekspresjonowane na zdrowych monocytach i aktywują reakcję immunologiczną po rozpoznaniu zanieczyszczeń pirogennych. Test aktywacji monocytów odtwarza tę reakcję gorączkową „w probówce”. Frakcja komórek CD14+ w populacji PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) zwykle wynosi około 10–20% całkowitej liczby PBMC, choć zakres może się nieco różnić w zależności od osoby (wiek, stan zdrowia, infekcje, stan zapalny), metody izolacji PBMC (np. wirowanie w gradiencie gęstości Ficoll) może wpływać na odzysk monocytów tak jak warunki przechowywania. Typowe proporcje komórek w świeżej próbce krwi to limfocyty T: ~60–80% PBMC, limfocyty B: ~5–15% PBMC, NK: ~5–10% PBMC, Monocyty (CD14+): ~10–20% PBMC. W praktyce — jeśli zdecydujemy się na izolację PBMC np. metodą wirowania w gradiencie gęstości Ficoll, to spodziewana ilość komórek CD14+ w tej frakcji to co dziesiąta do co piąta komórka. Przy wyborze rodzaju komórek do testu MAT pojawia się pytanie, które komórki najdokładniej wykrywają pirogeny, a jednocześnie są najbardziej odporne.

Pierwszym kryterium wyboru źródła komórek jest zatem odporność. Chcemy, aby komórki były wystarczająco wytrzymałe, by nie ulegały uszkodzeniom w wyniku zmian środowiskowych podczas transportu, wirowania, kriokonserwacji i wszystkich innych etapów testu MAT.

Drugim kryterium jest czułość komórek oraz powtarzalność wyników. Zmienność między różnymi dawcami jest jednocześnie pożądana jak i niepożądana: każdy dawca ma swój własny „profil” cytokinowy. W związku z tym odpowiedź komórek poszczególnych dawców różni się w zależności od rodzaju i ilości receptorów Toll-podobnych (TLR).

Ponadto, aby komórki były możliwie jak najbardziej czułe, a jednocześnie dostarczały wiarygodnych wyników, muszą wykazywać stabilną ekspresję receptorów TLR.

W konsekwencji drugie kryterium dotyczy równowagi między czułością a powtarzalnością wyników, ponieważ zmienność między dawcami zwiększa czułość, ale jednocześnie obniża powtarzalność. Która z tych cech będzie bardziej pożądana, zależy od celu testu.

Obecnie producenci testów MAT stosują różne rodzaje komórek: pierwotne komórki układu odpornościowego pochodzące z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC), nowotworową linię komórek monocytarnych Mono-Mac-6 (MM6), nowotworową linię komórkowąTHP-1 pochodzącą od pacjenta z ostrą białaczką monocytową. Komórki MM6 zostały wyizolowane z krwi pacjenta chorego na białaczkę. Są więc komórkami nowotworowymi, które dzielą się szybko. Można by więc przypuszczać, że takie źródło komórek będzie bardziej odporne niż PBMC, jednak dzielące się komórki nowotworowe są trudne do kontrolowania. Dlatego przed użyciem należy wykluczyć występowanie mutacji w tej linii komórkowej. Drugie kryterium — czułość i powtarzalność wyników — również nie jest spełnione, ponieważ wiadomo, że komórki MM6 wykazują zmienny poziom ekspresji receptorów TLR, co prowadzi do różnic w wynikach testów, zwłaszcza w odniesieniu do detekcji pirogenów niebędących endotoksynami.

THP-1 to ludzka linia komórkowa pochodząca z ostrej białaczki monocytowej, która jest szeroko stosowana w badaniach biologicznych, szczególnie w immunologii i farmakologii. Ponieważ podobnie jak MM6 pochodzi od pacjenta z białaczką monocytową ma podobne do tej linii zalety i wady. Metody badania pirogenów przy pomocy linii komórkowej THP-1 obejmują różnicowanie tych monocytów do makrofagów które posiadają wyższą ekspresję CD11b+ oraz CD14+ – markerów charakterystycznych dla monocytów co czyni je bardziej przydatnymi do badań niż same komórki THP-1.

PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) to heterogenna mieszanina ludzkich krwinek białych, a nie jedno źródło komórek. Komórki te są izolowane z pełnej krwi, a następnie przechowywane w stanie zamrożonym w temperaturze -180°C na czas transportu. Komórek PBMC nie można hodować, dlatego do każdego testu MAT potrzebna jest nowa fiolka PBMC. To stanowi pewne wyzwanie dla odporności komórek, ponieważ muszą one zostać zamrożone, przetransportowane i rozmrożone przed użyciem. Jeśli chodzi o czułość, PBMC mają przewagę nad MM6. Wykazują stabilną ekspresję receptorów TLR, co przekłada się na wysoką powtarzalność wyników. Podobnie wypada porównanie z linią komórkową THP-1, która jednak po różnicowaniu estrem forbolu (PMA) zwiększa ekspresję TLR2 i TLR4, co zwiększa reakcję na LPS i ligandy bakteryjne. W wyniku różnicowania rośnie również ekspresja TLR8.

Kwestia wyboru między PBMC od pojedynczego dawcy a PBMC pochodzącymi od kilku dawców (tzw. pooled PBMC) jest przedmiotem dyskusji w środowisku zajmującym się testem aktywacji monocytów. Podczas wykonywania testu pirogenności z wykorzystaniem PBMC od pojedynczych dawców, MAT przeprowadza się na próbkach pochodzących od kilku dawców, wg. Ph.Eur minimum czterech. Oznacza to wykonanie testu cztery razy, aby uzyskać pełny wynik, co wiąże się z większym nakładem pracy i czasu. Zaletą tej metody jest jednak to, że dane każdego dawcy analizuje się osobno, co pozwala uchwycić różnice indywidualne wynikające z ich odmiennych profili cytokinowych. Każdy człowiek ma inny zestaw genów, a więc inny układ odpornościowy, który reaguje w sposób indywidualny na obecność pirogenów.

Nie istnieje więc jedna uniwersalna „czułość na pirogeny”, lecz raczej czułość wobec konkretnego pirogenu. Pirogeny wiążą się ze swoistymi receptorami TLR, a różnice między dawcami wynikają z różnych poziomów ekspresji tych receptorów. Na przykład, jeśli jeden z czterech dawców ma wyższy poziom TLR2, będzie bardziej wrażliwy na pirogen obecny w badanej próbce. Takie swoiste reakcje immunologiczne można wykryć tylko wtedy, gdy próbki od dawców są testowane osobno. Jeśli natomiast użyje się PBMC połączonych od różnych dawców (pooled), różnice między dawcami uśredniają się i nie są widoczne w wynikach testu. Oznacza to, że łączna czułość PBMC od pojedynczych dawców jest większa niż w przypadku PBMC łączonych, ponieważ w pierwszym przypadku podkreślane są różnice indywidualne, a w drugim — ulegają one zatarciu.

Dla uproszczenia można przyjąć, że PBMC pochodzące od czterech dawców stanowią przykład „pooled PBMC”. Wykonanie testu pirogenności z pojedynczymi dawcami wymaga czterech oddzielnych testów MAT, podczas gdy przy PBMC połączonych wystarczy jeden test. Dodatkowo, połączenie PBMC od kilku dawców powoduje, że różnice osobnicze się kompensują, co prowadzi do bardziej spójnych i powtarzalnych wyników.

Zgodnie z przepisami prawnymi, dopuszcza się zarówno testy z PBMC pochodzącymi od pojedynczych dawców, jak i testy z PBMC połączonych. Jednak w przypadku, gdy jeden wynik w teście z pojedynczymi dawcami okaże się pozytywny, należy powtórzyć badanie z udziałem czterech dawców. Jeśli wszystkie wyniki powtórnego testu będą negatywne, partia może zostać dopuszczona do obrotu.

W przypadku testów z PBMC połączonych, pojedynczy wynik pozytywny uległby uśrednieniu, co stanowi korzyść dla producenta, gdyż pozwala uniknąć powtarzania testu.

DYSKUSJA

Testy aktywacji monocytów (MAT) są nadal w fazie rozwoju. Wraz z rozwojem nowoczesnych technologii wytwarzania, takich jak produkcja szczepionek, białek, terapie komórkowe i genowe, pojawiają się nowe zagrożenia kontaminacją, które mogą być niewykrywalne przez tradycyjne metody testowania. Choć zasada MAT została opracowana kilkadziesiąt lat temu, jej szerokie wdrożenie w obszarze zaawansowanych produktów biologicznych znacząco przyspieszyło dopiero w ostatnich latach. W ciągu ostatnich lat producenci szczepionek, którzy wcześniej wykorzystywali RPT jako test zwalniania serii, jako pierwsi wdrożyli MAT. W przeciwieństwie do MAT, testy wykrywające endotoksyny bakteryjne często nie nadają się do produktów, które są z natury pirogenne lub zawierają dodatki powszechnie stosowane w szczepionkach, takie jak wodorotlenek glinu, który ma tendencję do zakłócania przebiegu testu (Hartung, 2021). Test Aktywacji Monocytów jest szczególnie odpowiedni do badania pirogenności szczepionek z kilku kluczowych powodów. Po pierwsze wykrywa wszystkie typy pirogenów, nie tylko endotoksyny. Tradycyjny test LAL/BET wykrywa wyłącznie endotoksyny bakteryjne (czyli pirogeny pochodzące z bakterii Gram-ujemnych). MAT natomiast reaguje na wszystkie rodzaje pirogenów – zarówno endotoksyny, jak i pirogenne substancje pochodzenia niebakteryjnego, np. z bakterii Gram-dodatnich, wirusów czy składników produktu. To ma ogromne znaczenie dla szczepionek, które mogą zawierać różne komponenty biologiczne i adiuwanty. MAT wykorzystuje ludzkie monocyty, które wydzielają cytokiny (np. IL-6, IL-1β, TNF-α) w odpowiedzi na obecność pirogenów. Dzięki temu test odzwierciedla reakcję ludzkiego układu odpornościowego, co czyni go bardziej biologicznie istotnym niż test na królikach. Nadaje się do produktów zawierających adiuwanty (np. wodorotlenek glinu) a wiele szczepionek zawiera adiuwanty aluminiowe (np. Al(OH)₃), które zakłócają wyniki testu LAL. MAT nie jest podatny na te interferencje, ponieważ ocenia biologiczną odpowiedź komórek, a nie reakcję chemiczną. To sprawia, że MAT jest bardziej uniwersalny dla szczepionek o złożonym składzie.

Test MAT zastępuje testy na zwierzętach spełniając wymogi zasady 3R (Replacement, Reduction, Refinement) dotyczącej ograniczania badań na zwierzętach. Główną wadą testu pirogenności na królikach jest bardzo duże wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych – na całym świecie zużywa się około 400 000 królików rocznie. Metoda wymaga użycia co najmniej trzech zwierząt, z których wszystkie muszą wykazać taki sam wynik. Jeśli jeden królik rozwinie gorączkę, a pozostałe dwa nie, test uznaje się za nieważny i należy go powtórzyć. W praktyce oznacza to konieczność użycia znacznie większej liczby królików, co zwiększa zarówno wykorzystanie zwierząt, jak i koszty ich utrzymania. Kolejnym istotnym ograniczeniem jest duża zmienność wyników, co obniża powtarzalność testu. Ponadto reakcja gorączkowa u królika nie zawsze odzwierciedla odpowiedź człowieka, co zmniejsza wartość translacyjną metody. Jak wspomniano powyżej test króliczy nie może być stosowany do wszystkich produktów farmaceutycznych. Jest nieodpowiedni dla chemioterapeutyków i leków immunosupresyjnych, a jego zastosowanie do wyrobów medycznych jest technicznie trudne ze względu na biologiczne ograniczenia metody. Co ciekawe również test LAL stosowany do wykrywania endotoksyn, pomimo że jest testem in vitro wykorzystuje do badania krew skrzypłoczy. Co prawda skrwawione skrzypłocze po wykonaniu procedury są ponownie wypuszczane na wolność, jednak wykazano, że po skrwawieniu żyją one znacznie krócej niż bez ingerencji.

Jak przygotować firmę do zmiany? – plan działania.

Po pierwsze należy wykonać analizę ryzyka i gap assessment – identyfikację, które produkty i procesy wymagają zmiany metody. Wybór laboratorium i technologii – wdrożenie MAT wewnętrznie lub poprzez outsourcing. Następnie należy przeprowadzić optymalizację oraz walidację metody – zgodnie z wytycznymi ICH Q2(R2) i Ph. Eur. 2.6.30. Jednocześnie należy zadbać o aktualizację wewnętrznych procedur i systemów jakości. Koniecznie należy pamiętać o zgłoszeniu zmiany do URPL/EMA.

Wdrożenie MAT wymaga specjalistycznego sprzętu i know-how. Współpraca z laboratorium zewnętrznym ma wiele zalet w tym pozwala zmniejszyć koszty dzięki wsparciu wykwalifikowanego personelu, skrócić czas walidacji oraz zapewnić zgodność z wymaganiami farmakopei. Jagiellońskie Centrum Innowacji świadczy usługi badawcze na zlecenie klientów w zakresie analiz biologicznych, fizykochemicznych i mikrobiologicznych zgodnie z wdrożonymi i certyfikowanymi normami PN-EN ISO 13485:2016 oraz PN-EN ISO 9001:2015. Nasze laboratorium Analiz Biologicznych posiada doświadczenie w walidacji i wykonywaniu badań MAT, wspierając producentów leków i wyrobów medycznych w przygotowaniu do zmiany regulacyjnej.

Nie wszystkie wyroby medyczne muszą być badane pod kątem obecności pirogenów, obowiązek zależy od ich przeznaczenia, klasy ryzyka oraz sposobu kontaktu z organizmem pacjenta. Badanie to jest wymagane wszędzie tam, gdzie istnieje ryzyko, że pirogeny mogą zostać wprowadzone bezpośrednio do krwiobiegu lub jałowych tkanek. Wyroby przeznaczone do implantacji, takie jak protezy biodrowe, muszą być całkowicie wolne od pirogenów, aby zapewnić bezpieczeństwo pacjentów. Zanieczyszczenia pirogenne są często związane z powierzchnią wyrobu i mogą nie być rozpuszczalne w roztworach płuczących. Tradycyjne testy mogą nie wykrywać pirogenów związanych z powierzchnią natomiast test aktywacji monocytów zapewnia pełne wykrywanie zanieczyszczeń czyniąc MAT najbardziej kompleksowym i fizjologicznie istotnym testem pirogenności dla wyrobów medycznych. Wyroby mające bezpośredni kontakt z krwią takie jak cewniki naczyniowe (np. centralne, tętnicze, dializacyjne), dializatory i zestawy do dializy, zestawy do infuzji i transfuzji, pompy infuzyjne mające kontakt z płynami dożylnymi, kaniule, igły, wenflony obowiązkową muszą być badane pod kątem obecności pirogenów. Podobnie jak wyroby wprowadzane do jałowych tkanek lub narządów, wyroby stosowane podczas operacji lub implantowane do organizmu, które mają kontakt z obszarami normalnie jałowymi. Przykładami implanty ortopedyczne (np. protezy stawów, śruby, płyty, gwoździe), implanty kardiologiczne (np. zastawki serca, stenty, prowadniki), zestawy chirurgiczne, soczewki wewnątrzgałkowe. Również wyroby używane w produkcji lub podawaniu terapii zaawansowanych (ATMP) mają bardzo wysokie wymagania ze względu na ryzyko kontaminacji i poważne konsekwencje kliniczne. Sprzęt używany do przygotowania, przechowywania lub podawania leków i płynów infuzyjnych. Zestawy do żywienia pozajelitowego, pojemniki na roztwory do infuzji, systemy do podawania leków cytotoksycznych, systemy do terapii genowych lub komórkowych.

Produkty biologiczne powinny spełniać najnowsze wymagania regulacyjne i korzystać z najbardziej zaawansowanych dostępnych metod testowania. Nasze proaktywne podejście, bogate doświadczenie oraz kompleksowe usługi w zakresie badań pirogenności mogą pomóc zminimalizować ryzyko, wyprzedzić zmieniające się standardy i sprawnie wprowadzać produkty biologiczne na rynek.
Zmiana metod badania pirogenności to nie tylko wyzwanie, ale też okazja, by podnieść standardy bezpieczeństwa i jakości w branży farmaceutycznej, jednocześnie rezygnując z testów na zwierzętach.