Zielone aspekty oznaczania nitrozoamin w substancjach i produktach leczniczych

W lipcu 2018 odkryto obecność N-nitrozodimetyloaminy (NDMA), związku chemicznego należącego do grupy nitrozoamin (NA), w substancji czynnej – walsartanie. To odkrycie uruchomiło całą lawinę podobnych zdarzeń, np. obecność tych zanieczyszczeń udokumentowano również w innych sartanach (losartan, kandesartan itd.), metforminie, czy ranitydynie. Warto zauważyć, że większość cząsteczek substancji czynnych i substancji pomocniczych występujących w produktach leczniczych to związki zawierające grupy aminowe, które w sprzyjających warunkach mogą ulegać nitrozowaniu. Przeglądy produktów leczniczych przeprowadzane przez Komitet ds. Produktów Leczniczych Stosowanych u Ludzi (Committee on Medicinal Products for Human Use – CHMP) Europejskiej Agencji Leków potwierdziły obecność NDMA w niektórych partiach produktów leczniczych zawierających ranitydynę (leków stosowanych m.in. w stanach dyspeptycznych i chorobach wrzodowych dwunastnicy i żołądka), leków zawierających metforminę, stosowanych w leczeniu cukrzycy. Wycofania z rynków powyższych leków pozbawiło wielu pacjentów preparatów, które przyjmowali regularnie. W przypadku metfominy jest to lek pierwszego rzutu i najważniejsza substancja używana do leczenia cukrzycy typu II. W Polsce około 2 mln pacjentów przyjmuje ten lek. Całkowicie z rynku wycofano wszystkie produkty lecznicze zawierające ranitydynę. Wycofanie z rynku walsartanu dotyczyło około 2300 partii tej substancji, które trafiły do Niemiec, Norwegii, Finlandii, Szwecji, Węgier, Holandii, Austrii, Irlandii, Bułgarii, Włoch, Hiszpanii, Portugalii, Belgii, Francji, Polski, Chorwacji, Litwy, Grecji, Kanady, Bośni i Hercegowiniy, Bahrajnu i Malty. Firmy farmaceutyczne straciły ze swojego portfolio wiele leków o dużym udziale rynkowym, notując duże straty finansowe oraz wizerunkowe. Przedsiębiorstwa farmaceutyczne, aby uniknąć wycofań z rynku swoich produktów zostały zobligowane do przeprowadzenia analiz ryzyka dla swoich produktów oraz testów weryfikujących obecność zanieczyszczeń.

Celem laboratoriów firm farmaceutycznych jest opracowanie specyficznych, odpowiednio czułych, dokładnych i precyzyjnych metod analitycznych, które będą wykorzystywane w procesie oceny ryzyka wystąpienia nitrozoamin, będą częścią dokumentacji rejestracyjnej oraz pozwolą na analizę nitrozoamin w szerokim wachlarzu produktów leczniczych. Metody oznaczania nitrozoamin w produktach leczniczych, to głównie analizy śladowe, co wymusza zastosowanie układu chromatograficznego sprzężonego ze spektrometrem mas, aby osiągnąć możliwie najniższe granice wykrywalności i oznaczalności. Próbki z farmaceutykami (produkty lecznicze, wyroby medyczne) są często złożonymi matrycami. Nitrozoaminy to w większości substancje mutagenne i rakotwórcze, dla których wyznaczono bardzo niskie dopuszczalne poziomy dziennego pobrania [2] i ich obecność w produktach leczniczych musi być ściśle kontrolowana. Biorąc pod uwagę wielkość rocznej produkcji niektórych produktów leczniczych, należy rozważyć obniżenie jednostkowych kosztów analiz. Większość metod oznaczania nitrozoamin w substancjach leczniczych i produktach gotowych, które powstały i są stosowane przez certyfikowane laboratoria agencji FDA i EDQM, to metody z prostym przygotowaniem próbki z wykorzystaniem procesów mielenia, rozpuszczania, mieszania mechanicznego, wirowania i stosowania ultradźwięków. Zmiana układu chromatograficznego oraz metody detekcji nie jest zalecana, ale można uzyskać pewne oszczędności na etapie przygotowania próbki do analizy poprzez zastosowanie miniaturyzacji i zmniejszenie zużycia rozpuszczalników (techniki mikroekstrakcji), energii elektrycznej czy nakładu pracy ludzkiej w procedurach laboratoryjnych.

Główną grupą technik ekstrakcji wykorzystywanych w metodach oznaczania nitrozoamin jest ekstrakcja ciecz/ciecz. Pierwszym krokiem jest rozpuszczenie próbki stałej w wodzie lub buforze o odpowiednim pH i wymieszanie. Kolejnym krokiem jest ekstrakcja nitrozoamin do rozpuszczalnika organicznego, zwykle dichlorometanu. Faza organiczna jest filtrowana po odwirowaniu i wprowadzana do odpowiedniego systemu chromatograficznego. Zwykle procedury analityczne w tych badaniach z przygotowaniem ciekłych próbek pochłaniają duże ilości toksycznych rozpuszczalników i zarazem produkują toksyczne odpady rozpuszczalnikowe. Wymagają dużych ilości próbki do analizy, aby otrzymać akceptowalne poziomy czułości. Te analizy nie spełniają części zasad Zielonej Chemii Analitycznej.

Przygotowanie próbki przed analizą instrumentalną jest ważną częścią kompletnego schematu analitycznego, który może znacząco wpłynąć na późniejsze wyniki jakościowe i ilościowe. Jest to również część metody analitycznej, która determinuje całkowitą czasochłonność metody i zazwyczaj zajmuje około dwóch trzecich całkowitego czasu potrzebnego na wykonanie analizy. Przygotowanie próbki zazwyczaj obejmuje etapy izolacji analitu z matrycy, oczyszczania i wstępnego wzbogacania w celu uzyskania odpowiedniego stężenia analitów do wymagań metod separacji i wykrywania [3]. W rezultacie bardzo ważne jest, aby ten krok był "bardziej ekologiczny", zwłaszcza jeśli próbki charakteryzują się wysokim stopniem złożoności matrycy. Ostatnie postępy w technikach przygotowywania próbek koncentrują się na automatyzacji, miniaturyzacji i uproszczeniu procedur ekstrakcji.

Techniki mikroekstrakcji znajdują coraz większe zastosowanie na etapie przygotowania próbki przed chromatograficznym oznaczaniem analitów w analizach śladowych w próbkach o złożonym składzie. Te rozwiązania pozwalają ograniczyć negatywny wpływ tego etapu analitycznego na środowisko i zdrowie pracowników laboratorium. Techniki mikroekstrakcyjne Wśród technik mikroekstrakcyjnych wyróżnia się: ekstrakcje do fazy stałej (SPE – Solid Phase Extraction), należą do niej takie techniki jak:

-mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME – Solid Phase Microextraction)
-mikroekstrakcja do fazy stałej z wykorzystaniem upakowanego sorbentu (MEPS – Microextraction by Packed Sorbent)
-mikroekstrakcja do fazy stałej z wykorzystaniem wirującego elementu sorbcyjnego (SBSE – Stir-Bar Sorbtive Extraction)
– nanoekstrakcja do fazy stałej (SBNE – Solid Phase Nanoextraction) ekstrakcje ciecz-ciecz (LLE – Liquid-Liquid Extraction) i w obrębie tej grupy wyróżnia się techniki:
– mikroekstrakcja do pojedynczej kropli (SDME – Single Drop Microextraction)
-mikroekstrakcja w układzie ciecz-ciecz z wykorzystaniem membrany porowatej (HF-LPME – Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction)
-dyspersyjną mikroekstrakcję w układzie ciecz-ciecz (DLLME – Dispersive Liquid-Liquid Micoextraction)

Przykłady wykorzystania technik mikroekstrakcyjnych w analizach oznaczania nitrozoamin w produktach leczniczych.

Literatura obejmuje kilkadziesiąt metod oznaczania nitrozoamin z różnymi sposobami przygotowania próbki do analizy. Ciekawą metodą jest ekstrakcja ciecz/ciecz składająca się z dwóch etapów.

Sproszkowane tabletki zwilża się octanem etylu, dodaje wodę i wytrząsa. Warstwę octanu etylu zbiera się i przemywa dwiema porcjami wody. Połączone ekstrakty wodne są analizowane w odpowiednim systemie chromatograficznym, w tym przypadku LCMS. Zastosowanie reekstrakcji umożliwia oczyszczenie końcowego ekstraktu, ale czyni procedurę bardziej skomplikowaną. Zastosowanie octanu etylu, rozpuszczalnika zaliczanego do przyjaznych środowisku spełnia jedno z podstawowych kryteriów Zielonej Chemii Analitycznej[4].

Ostatnio pojawiają się w literaturze badania z zastosowaniem techniki mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME) z wykorzystaniem włókna pokrytego poliakrylanem (Poly Acrylate). Analizuje się tylko N-dimetylonitrozoaminę, która jest zanieczyszczeniem w produktach leczniczych z ranitydyną. Zastosowano właśnie tę technikę ze względu na termolabilność substancji aktywnej, co wyklucza zarówno bezpośrednią analizę ekstraktów uzyskanych techniką ciecz-ciecz jak i przygotowanie próbki techniką „headspace”, ponieważ ranitydyna łatwo ulega degradacji w wysokiej temperaturze. Zastosowanie techniki SPME zdecydowanie zmniejsza degradację oraz eliminuje wyniki fałszywie dodatnie [5]. Kolejne zastosowania techniki mikroekstrakcji do fazy stałej zawierają publikacje [6], [7]. W opracowaniach wykorzystuje się włókno do mikroekstrakcji pokryte warstwami diwinylobenzenu z carboxenu i polydimetylosiloksanem (50/30 μm DVB/Carboxen/PDMS).

Shen i Andrews [8] wykorzystali jedną z odmian ekstrakcji do fazy stałej – dyspersyjną SPE do badania procesu nitrozowania substancji leczniczych obecnych w wodzie podczas chlorowania. Nitrozoaminę (NDMA – N-nitrozodimetyloaminę) ekstrahowano z roztworu wodnego przy użyciu kopolimeru styrolu diwinylobenzenu (DVB) i następnie wymywano dichlorometanem (objętość 500 μL). W tej procedurze ograniczono zużycie toksycznego rozpuszczalnika do minimalnych ilości, co jest zgodne z jedną z Zasad Zielonej Chemii.

Innym rozwiązaniem, które jednocześnie służy minimalizacji zużycia rozpuszczalników organicznych jak i pozwala na znaczące zatężenie analitu w końcowym ekstrakcie, jest dyspersyjna mikroekstrakcja ciecz/ciecz (DLLME). Wstrzyknięcie roztworu – chloroformu w metanolu do roztworu wodnego substancji leczniczej powoduje powstanie bardzo drobnych kropelek chloroformu o ogromnej całkowitej powierzchni międzyfazowej, dzięki czemu ekstrakcja do rozpuszczalnika zachodzi niemal natychmiast. Mieszaninę odwirowuje się, a następnie kroplę z dna stożkowej probówki umieszcza się w fiolce i analizuje w odpowiednim systemie chromatograficznym. Niewielkie ilości niezbędnej próbki i niebezpiecznych rozpuszczalników (około 150 mg próbki oraz 150 μl chloroformu w 0,5 ml metanolu) użytych do przygotowania próbki klasyfikują tę procedurę jako technikę przyjazną środowisku [9].

Techniki mikroekstrakcyjne to główny obszar implementacji zasad Zielonej Chemii Analitycznej w analityce nitrozoamin w substancjach leczniczych i produktach gotowych. Większość leków wymaga opracowania uniwersalnych, ekonomicznych, szybkich i odpowiednio czułych metod analitycznych do oznaczania nitrozoamin. Istnieje kilka aspektów, które należy wziąć pod uwagę podczas opracowywania metod potrzebnych do prawidłowego oznaczania ilości śladowych. Wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na uproszczonym (np. rozpuszczenie) przygotowaniu próbki lub prostej ekstrakcji ciecz/ciecz. Tradycyjna ekstrakcja ciecz/ ciecz z reguły nie spełnia zasad Zielonej Chemii ze względu na duże ilości użytych rozpuszczalników i ich toksyczność oraz zagrożenie dla środowiska. Całkowita eliminacja lub znaczące zmniejszenie ilości zużywanych rozpuszczalników podczas przygotowania próbek do analizy nitrozoamin w produktach leczniczych to cel, który można osiągnąć wdrażając techniki mikroekstrakcyjne. Ze względu na szybko rosnącą liczbę produktów objętych monitoringiem zawartości nitrozoamin, konieczne jest poszukiwanie nowych rozwiązań w przygotowywaniu próbek do analizy.

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Farmaceutycznego" 2/2023