Leki oparte o RNA – przełom w terapii chorób rzadkich oraz w rynku leków sierocych

Wprowadzenie

Znaczna część tradycyjnych leków małocząsteczkowych oddziałuje na poziomie reakcji metabolicznych katalizowanych przez białka poprzez regulację aktywności katalitycznej w organizmie – hamując ją (antagoniści) lub napędzając ją (agoniści). Obszar ten można dodatkowo rozszerzyć o leki małocząsteczkowe/wielkocząsteczkowe, które są zdolne ingerować w oddziaływania pomiędzy kilkoma białkami tworzącymi kompleks aktywny i w ten sposób regulować jego pracę odpowiednio do potrzeb terapeutycznych w zależności od etiologii pierwotnego procesu chorobowego. Z uwagi na powyższe, białka lub kompleksy białek stanowią atrakcyjny cel molekularny w przeważającej ilości dostępnych na rynku terapii. W przypadku takich chorób, które wymagają przywrócenia równowagi metabolicznej jest to podejście wystarczające. Z drugiej strony, istnieje gros chorób, których pierwotna przyczyna chorobotwórcza znajduje się na poziomie informacji genetycznej lub jej obróbki w procesach transkrypcji i translacji, a nawet jeszcze później na etapie modyfikacji posttranslacyjnych. Nie jest zatem możliwe zaproponowanie efektywnej terapii tych chorób przy użyciu wyżej wymienionych narzędzi terapeutycznych. Konieczne jest zatem użycie takich cząsteczek, które są zdolne do ingerowania w maszynerię transkrypcyjną/translacyjną. Istnieje kilka przedstawicieli z grupy leków małocząsteczkowych, które są zdolne do regulacji procesów na tym poziomie, jednak najbardziej oczywistą i najbardziej obiecującą grupą terapeutyków są leki oparte o RNA. Szczególnie widoczne jest to w terapii chorób rzadkich, gdzie produkcja leków sierocych wymaga często rządowej stymulacji zachęcającej przedsiębiorstwa farmaceutyczne do prowadzenia prac nad lekami sierocymi. Co więcej, modułowa budowa RNA jak również techniki produkcji i oczyszczania dają nadzieję na osiągnięcie w przyszłości pewnych aspektów medycyny spersonalizowanej przy jednoczesnym zmniejszeniu kosztów rozwoju z uwagi na opracowanie uniwersalnych platform do produkcji, oczyszczania i charakterystyki leków opartych o RNA. Obecnie na globalnym rynku istnieją jedynie produkty oryginalne zawierające RNA tzn. takie których rejestr oparty jest o pełną dokumentację kliniczną. Z racji obowiązujących patentów na substancję czynną, patentów produktowych, a także wyłączności rynkowych aktualnie brak jest produktów generycznych. Wyjątkiem jest rynek rosyjski, na którym w 2024 pojawił się generyczny odpowiednik produktu zawierającego nusinersen jako substancja czynna i gdzie trwa spór sądowy dotyczący ochrony patentowej tego produktu¹. W tabeli 1 zestawiono produkty lecznicze obecne na rynku łącznie z szerszą ich charakterystyką.

Pomimo rosnącej dynamiki na rynku leków RNA, aż do 2024 r. nie istniały żadne wytyczne Europejskiej Agencji Leków (EMA) oraz Amerykańskiej Agencji Leków (FDA). Jako pierwsze pojawiły się wytyczne na rynku amerykańskim (tzw. product specific guidance) i dotyczyły rozwoju produktów generycznych. W ślad za FDA 22 lipca 2024 roku EMA opublikowana projekt wytycznej dotyczącej rozwoju i wytwarzania produktów leczniczych opartych o oligonukleotydy². Jest to długo oczekiwana wytyczna wypracowana przez Regulatora oraz szereg firm zrzeszających się w ramach tzw. EPOC (ang. The European Pharma Oligonucleotide Consortium), która normalizuje zakres danych wymaganych przez Agencję do rejestracji.

Leki RNA można podzielić ze względu na długość łańcucha RNA (patrz schemat) na:

A. krótkie RNA (oligonukleotydy posiadające od 19 do 30 zasad) – wszystkie obecnie zarejestrowane leki z tej grupy są pochodzenia syntetycznego tzn. są uzyskiwane w wyniku chemicznej syntezy na podłożach stałych. Do tej grupy RNA zaliczamy:

• antysensowne RNA (ASO) zbudowane z jednej nici,
• interferencyjne RNA (RNAi) – zbudowane z dwóch, komple- mentarnych do siebie nici lub pojedynczej nici tworzącej we- wnętrzny dupleks (fragment dwuniciowy RNA, gdzie następuje komplementarne parowanie zasad)
• aptamery – nazwa pochodzi od łacińskiego słowa aptus („pasować”) i greckiego słowa meros („część”) jednoniciowe fragmenty RNA, które tworzą struktury wyższego rzędu i w przeciwień- stwie do ASO i RNAi nie oddziałują poprzez oddziaływania komplementarne zależne od sekwencji. Aptamery wiązane są przez białka, lub ich części niebiałkowe (glikany, lipoglikany) blokując ich aktywność³,

B. długie RNA do których zaliczamy mRNA. mRNA jest angielskim skrótem od informacyjnego RNA (messenger RNA), który jest obecny w każdej komórce naszego ciała i jest unikalną matrycą do biosyntezy białka. Długość łańcucha mRNA może dochodzić do kilku tysięcy zasad a ogólna budowa została zaprezentowana na Rysunku 1.

Z uwagi na swoją długość mRNA można uzyskać w skali przemysłowej jedynie metodami biotechnologicznymi. Istotnym jest aby rozróżnić terapeutyczne mRNA od szczepionkowych mRNA, gdzie druga grupa ma zadanie prewencyjne podczas gdy pierwsza grupa faktycznie leczy. W dalszej części artykułu pominiemy tę grupę, ponieważ obecnie na rynku nie ma żadnego produktu leczniczego z substancją czynną będącą terapeutycznym mRNA.

Leki RNA zatem wykazują swoją aktywność na głębszym poziomie metabolicznym w porównaniu do tradycyjnych narzędzi terapeutycznych celujących w białka lub ich kompleksy. Działanie terapeutycznego RNA zaczyna się jeszcze przed ekspresją białka – w momencie dojrzewania mRNA, w procesie splicingu lub podczas finalnej translacji. Leki RNA mogą ingerować w nieustrukturyzowany fragment mRNA kodującego dowolne białko, nawet takie, które są uważane za nieodpowiednie cele molekularne z racji trudnego dostępu do domeny aktywnej⁴ dla terapeutyków nisko/wielkocząsteczkowych. Historia pojawienia się pierwszego leku RNA na rynku ma zaledwie 27 lat, lecz na sukces pierwszej rejestracji wpływ miało setki badaczy z różnych zakątków świata, którzy przez dziesięciolecia prowadzili badania nad różnymi aspektami związanymi z RNA. Warto wymienić te bardziej znaczące odkrycia, które wywarły największy wpływ na cały obszar terapeutycznych RNA jak⁵:

• 1983 – odkrycie krótkich komplementarnych RNA które hybry- dyzując z mRNA hamują rozpoznawanie go przez rybosomy,
• 1990 – odkrycie mechanizmu cięcia mRNA przez RNazę III po utworzeniu dwuniciowego RNA: oligonukleotyd-mRNA,
• 1998 – odkrycie interferencji RNA w Caenorhabditis elegans,
• 2001 – wywołanie interferencji RNA poprzez podanie siRNA w komórkach ludzkich,
• 2001 – odkrycie enzymu Dicer zaproponowanie mechanizmu RISC cięcia docelowego mRNA,
• 2006 – Fire i Mello zdobywają Nagrodę Nobla z fizjologii i me- dycyny za prace nad RNAi,
• 2023 – Karikó i Weissman zdobywają Nagrodę Nobla z fizjologii i medycyny za odkrycia dotyczące modyfikacji nukleozydów umożliwiających efektywne szczepionki mRNA przeciwko COVID-19,
• 2024 – Ambros i Ruvkun zdobywają Nagrodę Nobla z fizjologii i medycynie za odkrycie mikroRNA i wyjaśnienie post-transkryp- cyjnego regulowania genów z ich udziałem.

Do roku 2020 wszystkie zarejestrowane leki miały wskazanie do leczenia chorób rzadkich. Lek aby miał oznaczenie „sierocy” musi spełnić następujące warunki⁶:

• wskazanie w leczeniu, zapobieganiu lub diagnostyce chorób zagrażających życiu
• wskazanie w leczeniu choroby występującej nie częściej niż 5 na 10 000 lub nie generować przychodu pokrywającego nakłady inwestycyjne na lek. Jako ciekawostkę można dodać, że obecnie na rynku są zarejestrowane substancje dedykowane pojedynczym pacjentom⁷
• brak innej metody leczenia, zapobiegania lub diagnostyki choroby lub jeśli istnieje, nowy lek musi wykazywać istotne korzyści w porównaniu do istniejącej terapii.

W 2020 roku został wprowadzony pierwszy lek oparty o RNA – inclisiran, który nie jest lekiem sierocym i wskazany jest w leczeniu hipercholesterolemii rodzinnej poprzez wyciszanie białka PCSK9.⁸

Struktura RNA i jego funkcje

RNA jest biopolimerem, zbudowanych ogólnie z czterech podsta- wowych jednostek budulcowych (monomerów) – nukleotydów: adenozyna (A), guanozyna (G), cytydyna (C) i urydyna (U). Każda taka jednostka budulcowa zbudowana jest z części fosforanowej, części cukrowej i części purynowej/pirymidynowej (Rys 3).

Istotnym jest aby RNA był w roztworze stabilny termodyna- micznie, oporny na trawienie enzymatyczne i ewentualnie, jeśli to konieczne charakteryzował się dużą trwałością tworzonego dupleksu. Z tego powodu monomery są w istotnym stopniu chemicznie modyfikowane w części fosforanowej, cukrowej i na zasadach purynowych/pirymidynowych. Dekady pracy nad poprawą parametrów fizykochemicznych oligonukleotydów umożliwiły powstanie kolejnych generacji RNA o poprawionej stabilności, odporności enzymatycznej, niskiej immunogenności. Łańcuch RNA z racji posiadania wielu reszt fosforanowych, charakteryzuje się w warunkach fizjologicznych wysokim stopniem zjonizowania, co wspomaga rozpuszczalność RNA w wodzie, przestrzennie stabilizuje łańcuchy, utrudniając tym samym agregację. Z drugiej jednak strony wysoki stopień nałado- wania utrudnia przenikanie cząsteczki przez błonę komórkową do wnętrza cytoplazmy, gdzie większość RNA wykazuje swoją aktywność. Wspomniane właściwości wskazują że RNA może być zaklasyfikowane do klasy III BCS ⁹. RNA w produktach leczniczych występuje w postaci po- jedynczej nici RNA (ssRNA – single strand RNA) lub kom- plementarnych do siebie dwóch nici RNA (dsRNA – double strand RNA). To czy mamy do czynienia z podwójną nicią czy pojedynczą nicią ma fundamentalne znaczenie i determinuje mechanizm działania danej cząsteczki RNA.

Mechanizm działania leków opartych o RNA (ASO i siRNA)

Pierwszym podstawowym mechanizmem modulowania ekspre- sji białka jest technologia oligonukleotydów antysensowych. Są to jednoniciowe oligonukleotydy od 19-30 zasad, które po przedostaniu się do cytoplazmy mogą wykazywać działania na jeden z poniższych sposobów:

• wiązać się do docelowego mRNA. Powstały fragment dwuniciowy RNA jest rozpoznawany przez enzym RNAze H1, która przecina komplementarny mRNA co zmniejsza ilość powstającego białka – przykładem substancji czynnej z tej grupy jest fomivirsen.
• ASO może również zwiększać bądź zmniejszać ilość pra- widłowego białka poprzez wiązanie się do docelowego mRNA i zmianę schematu włączania egzonów do dojrzałego łańcucha mRNA (tzw. splicing mRNA10). Tę grupę reprezentuje np. nusinersen czy milasen 7.
• ASO może sterycznie blokować mRNA poprzez tworzenie silnego dupleksu, co uniemożliwia swobodne przesuwanie się rybosomów syntezujących białka po nici mRNA.

Można zauważyć więc, że podstawą działania ASO jest tworzenie dupleksu z mRNA. W związku z tym sam oligonukleotyd jak i doce- lowy fragment mRNA nie mogą tworzyć struktur wyższego rzędu, co w świecie wysoce ustrukturyzowanego RNA, jest osiągane poprzez precyzyjne projektowanie sekwencji oraz prowadzenie modyfikacji w obrębie cząsteczki oligonukleotydu.

Drugą ewolucyjnie zakonserwowaną ścieżką posttraskrypcyjnego wyciszania genów jest interferencja RNA. Podstawowym elemen- tem mechanizmu wyciszania jest cząsteczka dwuniciowego RNA, zbudowana z nici: sensownej i antysensownej o długości równej 21-23 zasad. Nić antysensowna jest komplementarna do fragmentu sekwencji mRNA, które chcemy wyciszyć (wyciszenie czyli zabloko- wane ekspresji białka) (patrz Rys 2). Wyciszanie zachodzi przy udziale kompleksu białkowego RISC, które po związaniu dwuniciowego RNA przecina komplementarną nić mRNA. Dwuniciowy RNA może być pochodzenia wewnątrzkomórkowego, wówczas taki RNA nazywamy mikroRNA lub otrzymany na drodze syntezy chemicznej i podany z zewnątrz do organizmu, wówczas nosi nazwę siRNA (ang. small interferring RNA).

Drogi podania leków

Wszystkie leki oparte o RNA obecne na rynku są podawane parenteralnie najczęściej w postaci:

• Podania podskórnego – leki RNA podane tą drogą charakteryzują się biodostępnością na poziomie od 25 do nawet 100%. Tą grupę reprezentują np. inclisiran i inotersen.
• Podania dożylnego jako zastrzyk lub wlew – przykładem substancji czynnych podawanych tą drogą są patisiran lub casimersen.
• Podania dordzeniowego – cząsteczki RNA wskazane w leczeniu chorób OUN, z racji swoich dużych rozmiarów i dużego stopnia zjonizowania nie przenikają przez barierę krew-mózg, stąd muszą być podawane bezpośrednio w zastrzykach przez nakłucie lędźwiowe do rdzenia lub po resekcji guza mózgu do jamy po guzie. Tą drogę podania reprezentują substancje czynne jak tofersen czy nusinersen.

Wyzwania stojące przed RNA

Istnieje wiele przeszkód dla terapii opartych o cząsteczki RNA. Pierwszym i najbardziej naglącym problemem jest brak przenikalności tych cząsteczek przez błony komórkowe. Dla technologii ASO i siRNA cele terapeutyczne znajdują się w cytoplazmie komórkowej. Błona komórkowa jest bardzo ścisłą barierą dla dużych i naładowanych ujemnie cząsteczek jakimi są RNA. Ciekawym podejściem w rozwią- zaniu problemu niskiej przenikalności są systemy dostarczania RNA w formie lipopleksów lub cząstek lipidowych (LNP). Obecnie na rynku terapeutyków oligonukleotydowych jest tylko jedna substancja zamknięta w LNP – patisiran. W wielu przypadkach, aby zwiększyć ilość leku przenikającego do wnętrza komórki wykorzystuje się specyficzne receptory np. asialoglikoproteinowy (ASGPR), który rozpoznaje znacznik GalNac kowalencyjnie związany z RNA. GalNac pełni rolę farmakoforu. Przykładem cząsteczek posiadających ten znacznik są inklisiran czy eplontersen.

Bezpieczeństwo terapii jest jednym z istotnych aspektów farmakoterapii. Podanie leków opartych RNA, jest jak w przypadku każdego leku obciążone ryzykiem powikłań jak reakcja odpornościowa lub zapalenie w miejscu podania. Przyczyną immunogenności jest aktywacja receptora wewnątrzkomórkowego TRL3, który rozpoznaje dwuniciowy RNA, TLR7 i TLR8 rozpoznające jednociowy RNA czy TLR9, który rozpoznaje niemetylowane dinukleotydy CpG ¹¹. W kontekście działań ubocznych czy niepożądanych należy brać pod uwagę również zanieczyszczenia obecne w leku bądź produkty metabolizmu, mogące obniżać skuteczność terapii.

Podsumowanie

Leki oparte o oligonukleotydy stanowią perspektywiczną grupę terapeutyków mogącą rozwiązać problem występowania chorób rzadkich, który związany jest z wysokimi kosztami prowadzenia terapii. Są one dyktowane w znacznej mierze niekorzystnym stosunkiem nakładów ponoszonych przez przedsiębiorstwa farmaceutyczne na rozwój produktów oraz przychodów z ich sprzedaży. Dotychczas ciężar kosztowy związany z prowadzeniem terapii jest przenoszony na system opieki zdrowotnej lub finansowany ze zbiórek charytatywnych. Popyt na leki sieroce nigdy nie będzie duży, w związku z tym

perspektywy rozwiązania tej patowej sytuacji można upatrywać w rozwoju modułowych platform oligonukleotydowych. Chemiczna synteza RNA składa się z powtarzalnych cykli, w których poszczególne oligonukleotydy (A, U, G, C) zestawia się ze sobą tworząc dopasowane do potrzeb sekwencje – gotowe narzędzia molekularne do regulacji poziomów ekspresji genetycznej będącej podstawą procesu chorobotwórczego. Budowanie kompetencji dotyczących sposobów wytwarzania RNA w skali przemysłowej oraz umiejętne oczyszczanie i charakterystyka produktu zgodnie z wymaganiami Regulatorów mogą stać się w niedalekiej przyszłości szytym na miarę rozwiązaniem problemów i potrzeb pacjentów z chorobami rzadkimi. Proces pozyskiwania tych kompetencji toczy się w ramach projektu dofinansowanego z budżetu państwa z Agencji Badań Medycznych pt. „Opracowanie uniwersalnej platformy szybkiego reagowania, opartej na technologii RNA, zapewniającej krajowe bezpieczeństwo lekowe i epidemiologiczne” – nr projektu 2021/ABM/05/00004-00, w której w ramach konsorcjum zrzeszony jest Instytut Chemii Bioorganicznej PAN oraz Polpharma S.A. Na zakończenie warto podkreślić modułowy charakter procesów projektowania i wytwarzania leków opartych o RNA, który z dużym prawdopodobieństwem może stać się solidnym fundamentem medycyny spersonalizowanej. Zbudowana infrastruktura oraz wypracowane procedury i kompetencje mogą posłużyć do wszechstronnego wykorzystania i produkcji leków oligonukleotydowych.