Techniki i wyzwania pomiaru tlenu rozpuszczonego w bioprocesach farmaceutycznych

Precyzyjny pomiar tlenu rozpuszczonego stanowi fundament stabilnych i powtarzalnych bioprocesów w przemyśle farmaceutycznym. To właśnie od jego kontroli zależy metabolizm komórek, wydajność hodowli oraz jakość produktów biologicznych. Wraz z rozwojem technologii i coraz bardziej złożonych procesów, znaczenie niezawodnych, łatwych

w walidacji i odpornych na zakłócenia metod pomiarowych szybko rośnie. Artykuł analizuje dostępne techniki, ich ograniczenia oraz główne wyzwania związane z monitorowaniem tlenu w środowisku regulowanym – ze szczególnym uwzględnieniem przewag technologii optycznej.

Znaczenie tlenu rozpuszczonego w bioprocesach – dlaczego to krytyczny parametr?

Tlen rozpuszczony (DO, dissolved oxygen) należy do kluczowych parametrów krytycznych, determinując aktywność metaboliczną, wzrost i produktywność kultur mikroorganizmów oraz komórek ssaczych. Niewystarczająca dostępność tlenu ogranicza szybkość oddychania, zmienia strumienie metaboliczne (np. przejście w metabolizm beztlenowy), a w konsekwencji może obniżać wydajność oraz jakość produktu. W podejściu Quality by Design oraz w ramach Process Analytical Technology (PAT) FDA, DO jest typowo monitorowane in-line i używane do sterowania napowietrzaniem, mieszaniem oraz ciśnieniem głowicowym, aby utrzymać ustalony punkt pracy w całym cyklu hodowli.

Przegląd technik pomiaru DO

Wybór technologii pomiaru tlenu rozpuszczonego zależy nie tylko od charakterystyki samego procesu, lecz także od wymogów re- gulacyjnych, stabilności metrologicznej oraz możliwości integracji z systemami automatyki.

Czujniki elektrochemiczne (amperometryczne)

Czujniki membranowe działają w oparciu o prostą zasadę: tlen przenika przez cienką membranę i trafia do wnętrza sensora, gdzie jest zużywany w reakcji elektrochemicznej zachodzącej na spolaryzowanych elektrodach. To właśnie ta reakcja generuje prąd proporcjonalny do ilości tlenu. Ponieważ jednak tlen jest konsumowany, odczyt może zależeć od ruchu cieczy i intensywności mieszania – jeśli wokół elektrody powstanie „zastój”, wskazanie będzie zaniżone.

Sondy tego typu wymagają obecności elektrolitu, membrany oraz okresowego kondycjonowania i serwisowania.

Czujniki optyczne (luminescencyjne)

Czujniki optyczne wykorzystują wygaszanie luminescencji barwnika (luminoforu) przez cząsteczki tlenu. Mierzą intensywność/ opóźnienie sygnału i – co kluczowe – nie zużywają tlenu w trakcie pomiaru. Odpada wymóg stałego przepływu czy intensywnego mieszania wyłącznie na potrzeby samego czujnika. Nie ma też membrany z elektrolitem, a więc maleje nakład obsługi i ryzyko błędów serwisowych. Zazwyczaj dają stabilny sygnał natychmiast po uruchomieniu.

Optyczna metoda pomiaru DO została sformalizowana m.in. w ISO 17289:2014. Norma opisuje procedury kalibracji, interferencje oraz wytyczne metrologiczne dla pomiarów terenowych, ciągłych i laboratoryjnych. To ważny punkt odniesienia dla walidacji i me- trologii w środowiskach regulowanych.

Kluczowe wyzwania pomiaru DO w środowisku bioprocesowym

Choć współczesne bioreaktory oferują coraz lepsze systemy sterowania, sam pomiar tlenu rozpuszczonego nadal niesie ze sobą kilka praktycznych trudności. Warto je dobrze poznać, bo często to właśnie one decydują o stabilności procesu, a nie sam rodzaj użytego sensora.

1. Zmienna hydrodynamika

W bioreaktorach – szczególnie przy większej skali lub w gęstych hodowlach – DO potrafi istotnie różnić się między strefami. Pę- cherzyki gazu nie rozkładają się równomiernie, a lokalne zaburzenia mieszania mogą prowadzić do niedotlenionych „kieszeni”. Sensor pokazuje więc wartość miejscową, a nie globalną, dlatego tak ważne jest rozumienie dynamiki transferu masy (kLa) i bilansu OTR/OUR.

2. Stabilność czujników i ograniczenia kalibracyjne

Czujniki DO pracują w środowisku, które może być dla nich wymagające – m.in. w trakcie cykli SIP/CIP, przy zmiennych temperaturach i wysokich stężeniach gazów. Elektrochemiczne wymagają polaryzacji i serwisu, a optyczne – kontroli czystości okna (przezroczystej powierzchni, przez którą sonda nadaje i odbiera światło) i starzenia kapsuły luminescencyjnej (warstwy z luminoforem, który reaguje na obecność tlenu).

W trakcie trwania hodowli pełna kalibracja sensora jest zazwyczaj niepraktyczna i mogłaby naruszyć aseptykę procesu – wyjęcie sondy, jej ponowna kalibracja i wprowadzenie do bioreaktora wiązałyby się z ryzykiem kontaminacji oraz przerwaniem ciągłości pomiarów. Dlatego tak ważna jest stabilność sygnału i przewidywalność zachowania czujnika od samego początku kampanii aż do jej zakończenia.

3. Różnorodność materiałów i konstrukcji bioreaktorów

W bioprocesach stosuje się zarówno nierdzewne STR, jak i systemy jednorazowe (SUB). Każde środowisko zachowuje się inaczej: w workach SUB grubość folii, sposób mieszania czy umiejscowienie okien optycznych mogą wpływać na lokalne nasycenie tlenem. Dobra wiadomość jest taka, że nie ma istotnych różnic jakości sygnału między instalacją inwazyjną a nieinwazyjną w systemach SUB – to pomaga ograniczyć ryzyko kontaminacji i uprościć pracę operatorów.

4. Interferencje i warunki procesu

Temperatura, ciśnienie, zasolenie czy pienienie mają bezpośredni wpływ na odczyty wartości DO.

• Czujniki elektrochemiczne reagują silniej, bo zużywają tlen i zależą od przepływu oraz stabilności membrany.
• Czujniki optyczne są mniej podatne na te zmienne, choć pogorszenie czystości okna optycznego lub biofouling mogą osłabiać ich sygnał.

Dlatego w praktyce ważna jest regularna kompensacja T/p, monitoring czystości powierzchni oraz kontrola warunków procesu.

5. Integracja pomiaru z systemami sterowania i automatyki

Pomiar DO może być wykorzystywany zarówno jako sygnał sterujący, jak i wyłącznie informacyjny – zależnie od procesu i przyjętej strategii kontroli. W części instalacji służy do regulacji napowietrzania, przepływów gazów czy mieszania, ale w innych pełni jedynie rolę wskaźnika nasycenia tlenem.

Niezależnie od sposobu użycia, integracja DO z systemami automatyki oraz danymi dodatkowymi – takimi jak off-gas, pH czy pCO2 – pozwala lepiej monitorować przebieg hodowli i szybciej wychwytywać odchylenia mogące wpływać na jakość procesu.

Przewagi czujników optycznych w aplikacjach biofarmaceutycznych

W większości współczesnych zastosowań biofarmaceutycznych – zwłaszcza w SUB, kulturach ssaczych i układach o ograniczonym mieszaniu – optyczne sondy DO stanowią domyślny wybór. Czujniki elektrochemiczne pozostają wartościową alternatywą w specyficznych warunkach, np. ze względu na koszty kapitałowe lub bardzo szybkie transjenty, gdzie kalibrowane systemy membranowe są już dobrze obeznane w danej organizacji.

Jakie główne argumenty przemawiają za wyborem cyfrowych czujników optycznych DO?

• Brak zużycia tlenu przez sensor – wiarygodność przy niskich przepływach, w gęstych lub lepkich pożywkach oraz w mikro- reaktorach; mniejsza wrażliwość na warunki hydrodynamiczne samego pomiaru.
• Niższe koszty operacyjne utrzymania – brak membran i elek- trolitów, brak polaryzacji; dłuższe interwały międzyobsługowe i mniejsza podatność na błędy serwisowe.
• Szybka gotowość pomiaru – sensor dostarcza wiarygodny sygnał od razu po uruchomieniu, co jest szczególnie ważne w krótkich kampaniach rozwojowych i przy częstych przezbrojeniach.
• Zgodność z systemami jednorazowymi – łatwa integracja w workach SUB (okna optyczne), możliwość instalacji nieinwazyjnej bez naruszania bariery aseptycznej.
• Standaryzacja metrologiczna – odwołanie do ISO 17289 ułatwia kwalifikację i audytowalność w środowiskach GMP.
• Lepsza stabilność długoterminowa – mniejszy dryft sygnału i rzadsze kalibracje w porównaniu z sondami elektrochemicz- nymi; potwierdzane w materiałach aplikacyjnych i badaniach porównawczych.
   
  W praktyce większości zakładów biofarmaceutycznych optyczne sondy DO zapewniają lepszy kompromis między stabilnością metrologiczną, kosztami operacyjnymi a ryzykiem procesu. Ograni- czają liczbę działań serwisowych, ułatwiają audyty i lepiej wspierają powtarzalność kampanii.
  

Rekomendacje wdrożeniowe dla zakładów farmaceutycznych

Aby pomiary tlenu rozpuszczonego realnie wspierały kontrolę procesu i jakość produktu, warto podejść do ich implementacji całościowo – od wyboru technologii, przez walidację, aż po rutynową eksploatację. Poniższe wskazówki podsumowują najważniejsze dobre praktyki.

1. Dobór technologii pomiarowej do rodzaju procesu

W hodowlach komórek ssaczych oraz w systemach jednorazowych najlepiej sprawdzają się optyczne czujniki tlenu rozpuszczonego, stosowane nieinwazyjnie i kalibrowane in situ przed zaszczepieniem. W fermentacjach mikrobiologicznych o wysokim zapotrzebowaniu tlenowym (OUR) warto stosować czujniki optyczne DO (z dbałością o czystość okna optycznego) lub dobrze znane sondy membranowe, pod warunkiem zapewnienia odpowiedniego przepływu i mieszania.

2. Walidacja i metrologia

Punktem odniesienia dla procedur pomiarowych powinna być norma ISO 17289, która precyzuje zakres metody, typowe interferencje oraz zalecenia kalibracyjne; warto też dokumentować niepewność pomiaru i planować regularne weryfikacje.

W systemach SUB należy kontrolować stabilność kapsuł optycznych, uwzględniając czas przechowywania, warunki sterylizacji oraz śledzenie historii komponentów.

3. Wykorzystanie DO w sterowaniu procesem i narzędziach PAT

Skuteczne wykorzystanie pomiaru DO wymaga jego ścisłego po- wiązania z głównymi pętlami regulacji w bioreaktorze – przede wszystkim z dozowaniem gazów (O2/air/N2), intensywnością mieszania oraz ciśnieniem roboczym. W praktyce duże korzyści daje stosowanie alarmów predykcyjnych, które analizują trendy DO, OTR i CO2 i sygnalizują zbliżające się odchylenia, zanim staną się problemem procesowym.

Równie ważna jest integracja pomiaru DO z systemami MES/SCA- DA oraz modelami cyfrowych bliźniaków. Dzięki temu operatorzy mogą śledzić stan bioreaktora w czasie rzeczywistym, a połączenie danych DO z analizą off gas pozwala trafniej ocenić kondycję kultury i szybciej wykrywać zaburzenia metaboliczne.

4. Transfer skali i znaczenie kLa

W punktach skali warto wykonywać rutynowe pomiary kLa (np. metodą gassing out) oraz wykorzystywać CFD do identyfikacji stref ubogotlenionych i optymalizacji ustawień procesowych.

5. Procedury eksploatacyjne

Należy wdrożyć klarowne zasady czyszczenia okien optycznych oraz harmonogram kontroli kapsuł, by zapobiegać biofoulingowi i utracie sygnału. W przypadku sond membranowych konieczne są: regularna wymiana membran i elektrolitu, kontrola polaryzacji oraz testy przepływu.

Podsumowanie

Precyzyjny, stabilny i audytowalny pomiar tlenu rozpuszczonego jest warunkiem koniecznym dla jakości i powtarzalności bioprocesów. Czujniki optyczne dzięki braku konsumpcji tlenu, uproszczonej obsłudze, kompatybilności z SUB i standaryzacji (ISO 17289) stały się w biofarmacji technologią pierwszego wyboru, szczególnie tam, gdzie wymagane jest monitorowanie in-line o wysokiej stabilności i niskim ryzyku ingerencji aseptycznej. Kluczem jest jednak całościowe podejście: kwalifikacja kLa i hydrodynamiki, integracja z PAT oraz spójne procedury metrologiczne – dopiero ten komplet gwarantuje, że wskazania DO realnie wspierają kontrolę jakości i efektywność produkcji.