Zanieczyszczenia mikrobiologiczne w produktach farmaceutycznych

Jednym z kluczowych elementów takiej jakości jest ta mikrobiologiczna, czyli czystość, jałowość i podatność na kontaminację wtórną, a także wydolność składników konserwujących. Analizy fizykochemiczne i mikrobiologiczne produktów leczniczych (oraz suplementów diety i wyrobów medycznych) wykorzystują wielorakie techniki, a w przypadku mikrobiologii – podłoży hodowlanych i odczynników. Wytwórcy zobowiązani są do przestrzegania wymagań sanitarnych i wymaganych reżimów higienicznych stanowiących zbiór zasad określonych przez GMP (ang. Good Manufacturing Practice – Dobrą Praktykę Wytwarzania).

Przegląd kluczowych parametrów mikrobiologicznych

Głównym źródłem kontaminacji w zakładach produkcyjnych są niedostatecznie umyte i zdezynfekowane powierzchnie i urządzenia oraz niedokładny poziom sanitarny wśród personelu mającego kontakt z otwartym produktem. Nie można oczywiście wykluczyć faktu, że niektóre rodzaje surowców niosą ze sobą naturalne ryzyko występowania zanieczyszczeń, bądź są syntezowane i dostarczane przez podmioty zewnętrzne, co jedynie zwiększa możliwości kontaminacji.

W przypadku surowców pochodzenia roślinnego zanieczyszczenia związane są przede wszystkim z bogatym w drobnoustroje ekosystemem, jakim jest gleba. Urodzajna ziemia zawierająca dużo substancji mineralnych i materii organicznych sprzyja rozwojowi nie tylko zwierzętom, ale przede wszystkim mniej wybrednym – bakteriom i grzybom. Grupę mikroorganizmów najczęściej izolowanych z gleby stanowią rodzaje: Bacillus, Clostridium, Streptomyces, Escherichia, Pseudomonas oraz grzyby pleśniowe: Fusarium i Penicillium. Ze względu na szerokie zastosowanie korzeni i łodyg roślin do produkcji wyciągów, to właśnie z części korzeniowych roślin identyfi kuje się większy stopień zanieczyszczenia mikrobiologicznego w porównaniu do jej części nadziemnych (liści, kwiatów).

Wśród badań jakościowych i ilościowych jałowości badanego materiału wyróżnić można trzy główne metody jego opracowania: posiew bezpośredni i posiew bezpośredni z wcześniejszą neutralizacją, które polegają na bezpośrednim wprowadzeniu próbki w zdefiniowanej ilości do podłoża hodowlanego (bezpośredni) oraz wcześniejszą neutralizacją substancji przeciwdrobnoustrojowej w nim zawartą za pomocą neutralizatora (bezpośredni + neutralizacja). Trzecią techniką jest filtracja membranowa polegająca na filtracji (najczęściej dotyczy wodnych preparatów) przez sączek o bardzo małych porach, których rolą jest zatrzymać na swojej powierzchni wszystkie występujące w fi ltrującym materiale mikroorganizmy.

Wszystkie produkty lecznicze uznawane jako niejałowe powinny spełniać określone kryteria czystości mikrobiologicznej. Kryteria te oparte są na ogólnej liczbie drobnoustrojów tlenowych (TAMC – ang. Total aerobic microbial count) i ogólnej liczbie drożdży i pleśni (TYMC – ang. Total yeast/mould count). Ponadto, kluczowym jest brak obecności konkretnych drobnoustrojów np. Escherichia coli (za wyjątkiem produktów doodbytniczych), Staphylococcus aureus (dla produktów przeznaczenia doustnego, na skórę lub donosowo), czy Candida albicans (dla produktów przeznaczenia dopochwowego). Wykrywanie obecności Staphylococcus aureus. Pojedyncza komórka tej Gram-dodatniej bakterii ma kształt kulisty, podręcznikowo określany mianem ziarniaka. W obrazie mikroskopowym po wybarwieniu metodą Grama, często prezentują się w postaci zbioru ziarenek przypominających kiść winogron, stąd ich potoczne nazewnictwo – gronkowiec.

Jest mikroorganizmem tlenowym i fakultatywnie beztlenowym. Oznacza to, że w przypadku błędu produkcyjnego lub laboratoryjnego łatwo przeżyje, a niekiedy namnoży się w różnych postaciach leku, od żeli i kremów, po kapsułki.

S. aureus jest czynnikiem etiologicznym wielu inwazyjnych chorób zakaźnych, takich jak infekcje skóry, zapalenie płuc i zatrucia pokarmowe. Z tego powodu jest niepożądany w końcowym produkcie leczniczym, a jego obecność, tak jak i wielu innych patogenów, stanowi zagrożenie dla konsumenta. Do najczęściej spotykanych infekcji wywoływanych przez ziarenkowce tego rodzaju należą: ropne stany zapalne skóry i tkanek miękkich np. ropnie, jęczmienie a także zapalenie płuc, wsierdzia i opon mózgowych. Gronkowcowe zatrucie pokarmowe spowodowane jest spożyciem pokarmu, w którym wytworzyły się ciepłostabilne oporne na działanie soku żołądkowego enterotoksyny.

Niezależnie od wyboru źródła literaturowego (Farmakopea/PN ISO) do wykrywania gronkowców wykorzystuje się dwa podstawowe podłoża hodowlane, o właściwościach wybiórczo-różnicujących. Oznacza to, że w swoim składzie chemicznym posiadają substancje, które wzmagają wzrost tej konkretnej grupy drobnoustrojów, dzięki czemu szanse na wykrycie chociaż pojedynczej kolonii tej bakterii jest zwiększona; a ponadto takie, które hamują wzrost innych mikroorganizmów, nie zaburzając obrazu na podłożu wzrostowym. Są to podłoża: Baird-Parker oraz MSA (ang. Mannitol Salt agar), na których powierzchni mikroorganizmy te tworzą charakterystyczne, wyróżniające się fenotypowo kolonie. A to wszystko za sprawą charakterystycznych przemian chemicznych oraz barwników.

Wykrywanie obecności Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa to fakultatywnie beztlenowa bakteria Gram-ujemna w kształcie pałeczek, która ma szczególne znaczenie w przemyśle farmaceutycznym i medycznym. Występuje powszechnie w środowisku naturalnym: w glebie, wodzie, a nawet jako część naturalnej flory ludzkiej skóry. Bakterie Gram-ujemne często bytują w płynach i wilgotnych środowiskach, dlatego mają szczególne znaczenie w farmaceutycznych systemach wodnych.

Ponieważ organizm ma tendencję do zarażania pacjentów z obniżoną odpornością, konieczne jest sprawdzenie, czy Pseudomonas nie występuje w gotowym produkcie farmaceutycznym, systemach wodnych i szpitalnym sprzęcie medycznym. Głównym celem jest zapobieganie przedostawaniu się bakterii do pacjentów, ponieważ leczenie infekcji Pseudomonas może być niezwykle trudne. P. aeruginosa ma bardzo niską podatność na antybiotyki poprzez szereg mechanizmów biologicznych. Jednym z nich jest obecność pomp wielolekowych, które są białkami aktywnie wypompowującymi szkodliwe cząsteczki z komórki. Jest to połączone z β-laktamazami, które rozkładają antybiotyki typu penicyliny. Te mechanizmy, między innymi w połączeniu z i tak już niską przepuszczalnością błony komórkowej, sprawiają, że P. aeruginosa jest niezwykle trudny do leczenia antybiotykami z głównego nurtu.

Z farmaceutycznego punktu widzenia monitorowanie obecności lub nieobecności Pseudomonas aeruginosa jest istotnym krokiem w analizie przyczyn źródłowych i utrzymaniu jakości wody farmaceutycznej. Jako gram-ujemny, ruchliwy organizm, P. aeruginosa może bardzo łatwo skolonizować źle utrzymany system wody oczyszczonej. Nagromadzenie biofi lmu może powodować długotrwałe problemy w systemie wodnym, ponieważ to mikrośrodowisko często chroni organizmy przed wieloma typowymi procesami sanityzacji, takimi jak ciepło i ozon.

Biofi lm można zdefiniować jako osiadłe zbiorowisko drobnoustrojów, charakterystyczne dla komórek przyczepionych do podłoża, interfejsu, lub do siebie nawzajem, osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowego polimeru. Bakterie wykazują zmieniony fenotyp w odniesieniu do wzrostu, ekspresji genów i produkcji białek. Biofi lmy mają wyspecjalizowaną architekturę, która zapewnia dobre samopoczucie poszczególnych komórek, które go tworzą. Złuszczanie poszczególnych komórek z biofi lmu kończy jego cykl rozwojowy. Gdy biofi lm jest obecny w systemie, jego usunięcie może być niezwykle problematyczne. Najlepszym rozwiązaniem jest zapobieganie gromadzeniu się P. aeruginosa poprzez odpowiednie zaprojektowanie systemu i jego regularne odkażanie. Identyfikacja P. aeruginosa z próbek systemu wodnego może być kluczowym wskaźnikiem zdrowia systemu wodnego.

Wykrywanie obecności pałeczek Salmonella i Escherichia coli. Bakterie zaklasyfi kowane do rodzaju Salmonella są Ggram-ujemnymi pałeczkami należącymi do rodziny Enterobacteriaceae. Mikroorganizmy te dobrze się rozwijają zarówno w warunkach tlenowych i beztlenowych oraz szerokim zakresie temperatur od 5 do 45oC. Podstawową cechą ich identyfi kacji na podłożach mikrobiologicznych jest fermentacja glukozy, natomiast brak rozkładu laktozy, lub sacharozy. Rodzaj Salmonella obejmują dwa gatunki: S. enterica i S. bongori, które odpowiadają za powszechnie nazywane salmonellozy, czyli zmiany chorobowe związane z przewodem pokarmowym. Są to bakterie wewnątrzkomórkowe, czyli po wniknięciu do organizmu człowieka, przedostają się do komórek nabłonka jelita cienkiego i w nich namnażając się, produkują toksyny odpowiedzialne za objawy chorobowe. W kontekście produktów leczniczych ich obecność będzie ściśle związana przede wszystkim z wykorzystaniem surowców roślinnych oraz całych części roślin (nalewki, ekstrakty).

Pierwszym krokiem przy analizie mikrobiologicznej produktu pod katem obecności pałeczek Salmonella jest odważenie 10 g/25 g tego produktu, w warunkach jałowych, oraz dodanie odważonej ilości do 90 ml/225 ml (przy zachowanym stosunku objętości 1:9) zbuforowanej wody peptonowej (ang. Buffered Peptone Water). Jest to klasyczna pożywka wykorzystywana do wstępnego, nieselektywnego namnażania bakterii, szczególnie chorobotwórczych Enterobacteriaceae z produktów leczniczych, żywnościowych oraz kosmetyków. Dopiero w kolejnej fazie nastąpi namnażanie selektywne, czyli w takim podłożu, które jest dedykowane tym bakteriom, co pozwoli na ich swobodny, bezstresowy wzrost i wykrycie w produkcie końcowym.

E. coli jest szeroko rozpowszechniona w jelicie grubym zwierząt stałocieplnych (w tym człowieka) i jest dominującą fakultatywnym beztlenowcem, który utrzymuje prawidłową fizjologię zdrowego gospodarza. E. coli taksonomicznie przynależy do rodziny Enterobacteriaceae, która obejmuje wiele rodzajów, w tym znane patogeny, takie jak Salmonella, Shigella i Yersinia. Chociaż większość szczepów nie jest uważana za patogeny, mogą one być patogenami oportunistycznymi, które powodują zakażenia u gospodarzy o obniżonej odporności. Istnieją również patogenne szczepy E. coli, które po spożyciu powodują choroby przewodu pokarmowego u zdrowych ludzi.

Do wykrycia obecności, bądź braku tych pałeczek w produkcie wykorzystuje się podłoże MacConkey’a w formie płynnej oraz stałej. Forma płynna umożliwia łatwe namnażanie pałeczek, których dokładny wzrost fenotypowy można później zaobserwować poprzez posiew na podłoże stałe. W swoim składzie chemicznym pożywka ta zawiera między innymi fiolet krystaliczny i sole żółci, które hamują wzrost bakterii Gram-dodatnich, dzięki czemu nie poświęca się czasu i uwagi na wzrost innych mikroorganizmów.

Oznaczanie ilościowe. W odróżnieniu do powyższych parametrów badań mikrobiologicznych, oznaczenie ilościowe nie jest ukierunkowane na konkretny typ drobnoustrojów, a na jego ogół, który w określonych warunkach będzie zdolny do wzrostu. Tak więc, jeżeli nie jest to sprecyzowane inaczej, do badania ogólnej liczby bakterii i grzybów najczęściej wykorzystuje się 10g lub 10 ml analizowanego produktu. Po uprzednim rozcieńczeniu produktu należy przygotować po dwie szalki Petriego dla każdego rozcieńczenia i podłoża. W kierunku określenia TAMC (ogólna liczba mikroorganizmów) płytki należy inkubować przez 3-5 dni w temperaturze 30-35oC na podłożu TSA (agar z hydrolizatem kazeiny i soi), natomiast dla TYMC (ogólna liczba drożdży i pleśni) przez 5-7 dni w temperaturze 20-25oC na podłożu Sabouraud z dekstrozą. Przyjmuje się, że liczba CFU znalezionych na podłożach agarowych odpowiada liczbie TAMC i TYMC.

Nie tylko laboratorium

Wymagania GMP, a co za tym idzie zasady prawidłowej produkcji produktów leczniczych odnoszą się do higieny całego łańcucha produkcyjnego. W Polsce warunkiem uzyskania zgody na wytwarzanie produktów leczniczych jest spełnienie wymogów zawartych w Rozporządzeniu Ministra Zdrowia z dnia 1 października 2008 roku dot. wymagań GMP. Elementy łańcucha produkcyjnego podległe ścisłej kontroli to także otoczenie prowadzonego procesu, do którego przynależą: powietrze, powierzchnia urządzeń, inne powierzchnie (podłogi, ściany, meble), personel i odzież robocza. Wszystkie te czynniki stanowią o potencjalnym negatywnym wpływie zaburzającym działanie procesu wyrobu produktów leczniczych, dlatego istotna i zalecana jest ich kontrola.

Czystość mikrobiologiczną powierzchni oraz personelu, czy odzieży można przeprowadzić wykorzystując metodę kontaktową płytek odciskowych lub wymazów. Z kolei jakość powietrza można ocenić za pomocą techniki uderzeniowej, w której pod wysokim ciśnieniem określona jednostka objętościowa powietrza zostaje wtłoczona i uderza o powierzchnie podłoża agarowego. Wszystkie te czynności muszą stanowić rutynową i systematyczną kontrolę pracowników produkcyjnych. Wraz z rozwojem i wprowadzaniem technologii do laboratorium, duży nacisk kładzie się na wykorzystywanie danych uzyskanych z pomiarów środowiskowych. Dzięki tym informacjom możemy jednoznacznie potwierdzić prawidłowość przeprowadzanych procesów, a tym samym zagwarantować odpowiednią jakość produkcji i jej otoczenia. Dodatkowo, monitoring danych pozwoli na eliminację niepożądanych efektów w czasie rzeczywistym.

Podsumowanie

Mikrobiologia w zakładzie produkcji farmaceutycznej w dużej mierze kładzie nacisk na aspekty związane z produkcją swoich wyrobów oraz ich trwałością. Źródłami potencjalnych zanieczyszczeń najczęściej bywają niedostatecznie zdezynfekowane i umyte powierzchnie mające bezpośredni kontakt z otwartym produktem, a także urządzenia lub niedokładność personelu (od pracownika produkcji, przez próbobiorcę, po laboranta). W produktach leczniczych podstawowymi parametrami mikrobiologicznymi, których obecność należy zweryfikować jest: (ilościowo) ogólna liczba drobnoustrojów tlenowych oraz drożdży i grzybów, a także kilka jakościowych – E.coli, S.aureus czy P.aeruginosa.

Bibliografia

1. Feng P., Weagant S., Grant M., Burkhardt W., BAM Chapter 4: Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria, 1998.
2. Ratajczak M., Kubicka M., Kamińska D., Sawicka P., Długaszewska J., Microbiological Quality of non-sterile pharmaceutical products. Saudi Pharmaceutical Journal, 2015.
3. Mena K., Gerba C., Risk Assessment od Pseudomonas aeruginosa in water. Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, 2009.
4. Farmakopea Polska. Wydanie XI, 2017. Tom I.
5. Bulanda M., Zawilińska B. i wsp.: Bakteriologia szczegółowa (w) Mikrobiologia lekarska, red. P.B. Heczko, M. Wróblewska, A. Pietrzyk, PZWL, Warszawa, 2014, s. 100–236
6. Jaśkiewicz M., Czystość mikrobiologiczna leków. Laborant; 7, 2014.
7. Marczewska J., Mysłowska K., GMP w przemyśle farmaceutycznym. LAB; 3, 2018.

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Farmaceutycznego" 4/2021