Wprowadzenie do spektrometrii mas

Kiedyś zastanawiano się co można mierzyć na spektrometrze masowym, który leżał nie raz odłogiem w laboratorium, w dzisiejszych czasach pytanie to zdecydowanie nie ma zastosowania, a raczej trudno znaleźć odpowiedź na całkiem przeciwne – czego nie możemy zmierzyć na spektrometrze mas? Biorąc pod uwagę fakt, że pomiar opiera się tylko i wyłącznie na określeniu masy badanego związku wydawałoby się, że ilość aplikacji powinna być ograniczona. W serii artykułów, które chce zaprezentować pragnę pokazać, że spektrometria mas jest techniką o nieograniczonych możliwościach, z tego też powodu podstawowa wiedza na temat tej technologii powinna być bardziej powszechna i łatwiejsza do zrozumienia.

Krótkie wprowadzenie do spektrometrii mas

Opisując spektrometrię mas w jednym zdaniu możemy powiedzieć, że jest to technologia, która powoduje powstanie związku badanego w formie gazowej, który następnie ulega separacji i detekcji ze względu jego stosunek masy do ładunku. Jednakże, każda ze składowych tego zdania tj. przekształcenie w formę gazową (jonizacja), rozdział oraz identyfi kacja wydaje się niezwykle skomplikowana i tak w rzeczywistości jest gdyż o każdym tym punkcie można by napisać nie tylko artykuł, a całą książkę. W celu łatwiejszego zrozumienia zasady działania spektrometru masowego wyobraźmy sobie i uprośćmy jego budowę do schematu poniżej:

Wyróżniamy trzy główne elementy składowe spektrometru mas: źródło jonów, gdzie substancja badana ulega jonizacji, analizator mas, gdzie powstałe jony podlegają separacji ze względu na swój stosunek masy do ładunku oraz detektor jonów, którego zadaniem jest rejestracja jonów wyselekcjonowanych przez analizator mas.

Źródło jonów – etap jonizacji

Pierwszym etapem analizy związków z spektrometrze masowym jest jonizacja. Jonizacja cząsteczek w źródle jonów może być przeprowadzona z wykorzystaniem różnorodnych technik, których lista została przedstawiona na Rycinie 1. Głównym założeniem etapu jonizacji jest naładowanie cząsteczek dzięki czemu będą mogły się w swobodnie poruszać w polu magnetycznym lub elektrycznym. Podczas zastosowania niektórych metod jonizacji może dojść do pękania słabych wiązań chemicznych przez co dochodzi do wstępnej fragmentacji cząsteczki. Najbardziej powszechnymi sposobami jonizacji są: elektrorozpraszanie (ESI, ang. electrospray ionization), jonizacja chemiczna (APCI, ang. atmospheric pressure chemical ionization), fotojonizacja (APPI, ang. aomospheric pressure photoionization) czy popularna w analizach białkowych jonizacja typu MALDI (ang. matrix-assisted laser desorption/ionization). Bardzo często wybór odpowiedniej metody jonizacji zależy od charakteru badanego analitu, ale również od rodzaju prowadzonego badania.

Analizator masy – etap rozdziału

Kolejnym elementem w układance nazywanej spektrometrem mas jest analizator. W mojej subiektywnej ocenie jest to najciekawsza część spektrometru mas i właśnie w tym artykule chciałbym położyć największy nacisk na odpowiedni wybór analizatora w zależności od planowanego zastosowania spektrometru. Ze względu na zainstalowany analizator zmienia się charakter danego spektrometru i jego potencjalne wykorzystanie. Z tego też powodu najwięcej uwagi powinniśmy poświęcić na doprecyzowanie potencjalnego zastosowania urządzenia. Pamiętamy, że w etapie tym skupiamy się na rozdziale jonów w zależności od ich stosunku masy do ładunku, pytanie jakie należy więc postawić brzmi: jak różne analizatory mas sobie z tym poradzą ? W tym momencie chciałbym przytoczyć słowa jednego z moich pierwszych mentorów z zakresu spektrometrii mas: „nie ma i nigdy nie powstanie idealny analizator masy, który będzie najlepszy do każdej aplikacji”. Słowa te padły ponad 30 lat temu i mimo ogromnego progresu jaki został poczyniony w rozwoju spektrometrii mas w tym okresie, stwierdzenie to jest jak najbardziej prawdziwe.

Jesteśmy aktualnie po etapie jonizacji, więc nasz analit porusza się wewnątrz spektrometru mas w formie zjonizowanej. Jak sugeruje tytuł, etap ten określamy momentem rozdziału jonów ze względu na ich stosunek masy do ładunku (m/z). Rozdział następuje w wyniku oddziaływania pola elektrycznego lub magnetycznego na poruszające się w próżni jony analitu. Ze względu na panującą próżnię ruch jonów nie jest zaburzony poprzez zderzenia z cząsteczkami gazów i ich mobilność jest regulowana tylko poprzez wpływ pola elektrycznego lub magnetycznego.

W swojej dotychczasowej karierze miałem przyjemność pracy z każdym z wymienionych na Rycinie 2 analizatorów mas, jednakże jak wspomniałem wcześniej nie ma złotego środka i w zależności od tego jakie związki i jakiego rodzaju badania chcemy przeprowadzić, taki analizator powinniśmy wybrać.

Kwadrupol

Najpopularniejszym analizatorem mas aktualnie dostępnym na rynku jest kwadrupol. Jak sama jego nazwa wskazuje jest zbudowany z czterech, symetrycznie ułożonych, równoległych metalowych prętów określanych również elektrodami. Elektrody leżące przeciwlegle są ze sobą połączone elektrycznie. Ze względu na przyłożone napięcie do prętów kwadrupola powstaje pole elektromagnetyczne, wzdłuż którego mogą się poruszać tylko specyfi czne jony. Kwadrupol działa jak filtr masy – przepuszcza tylko jony o określonym stosunku masy do ładunku, a pozostałe ulegają rozproszeniu i nie przechodzą przez analizator. Często działanie kwadrupola jest porównywane do odbiornika radiowego, gdyż poprzez odpowiednie ustawienie przykładanego napięcia i natężenia do prętów kwadrupola jesteśmy w stanie tak ustawić analizator aby przepuszczał tylko pożądane jony. Schemat działania kwadrupola został przedstawiony na Rycinie 2.

Analizatory kwadrupolowe są bardzo często wykorzystywane w laboratoriach chemicznych do potwierdzenia masy związku lub badania obecności potencjalnych zanieczyszczeń powstałych w czasie syntezy chemicznej. Analizatory typu pojedynczego kwadrupola (o analizatorach tandemowych, opowiemy troszkę później) są tak popularne ze względu na szybkość prowadzonych analiz, stosunkową niską cenę jak i możliwość uzyskania informacji ilościowej względem badanych jonów.

Analizator czasu przelotu

W spektrometrze masowym z analizatorem typu TOF (ang. Time Of Flight), czyli analizatorem czasu przelotu, stosunek masy do ładunku jest określony poprzez pomiar czasu jaki potrzebuje dany jon aby dotrzeć do detektora. Wszystkie jony podróżujące wewnątrz analizatora TOF o kształcie tuby są wcześniej przyspieszane z wykorzystaniem pola elektrycznego. Rozdział jonów o potencjalnie różnych masach opiera się na różnej prędkości jonów poruszających się w próżni, z których każdy ma taką samą energię kinetyczną. Zasadniczo lżejsze jony docierają do detektora przed cięższymi i dla każdego jonu docierającego do detektora jest rejestrowane widomo masowe. Zamieszczony na Rycinie 3 schemat przedstawia zasadę działania analizatora czasu przelotu.

Niewątpliwą zaletą analizatorów masy typu TOF jest prostota ich budowy oraz zasady działania – jak wspomniano rozdział jest zależny od prędkości jakie uzyskują zjonizowane cząsteczki w próżni w następstwie przyłożonego pola elektrycznego. Analizator ten wykazuje się również stosunkowo dużą wytrzymałością oraz szybkością skanowania. Nie można również nie wspomnieć o kluczowej zalecie tego typu analizatora, czyli praktycznie nieograniczonym zakresie mierzonych mas. Z tego też powodu analizatory te znalazły powszechne zastosowanie w badaniu związków wielkocząsteczkowych.

Z drugiej strony podstawowym ograniczeniem analizatora TOF jest ograniczona rozdzielczość, co jest związane ze stosunkowo dużym rozkładem czasu przelotu między identycznymi jonami.

Liniowa pułapka jonowa

Jak sama nazwa wskazuje analizator ten działa na zasadzie pułapkowania jonów. Liniowa pułapka jonowa jest odmianą kwadrupolowego analizatora mas, gdyż podobnie jak kwadrupol wykorzystuje zestaw równoległych prętów połączonych na swoich końcach z elektrodami. Przyłożenie odpowiedniego potencjału elektrycznego utrzymuje jony w środku analizatora, a następnie dochodzi do uwolnienia jonów o określonym stosunku masy do ładunku, które wędrują do detektora. Specyficzna konfiguracja tego typu analizatora daje mu podwójną funkcjonalność – może być używany jako kwadrupolowy filtr masy jak i pułapka jonowa. Cechą charakterystyczną tego analizatora jest niewątpliwie wysoka czułość stąd też pułapki jonowe są stosowane do analizy próbek, gdzie stężenie badanego związku jest bardzo niskie.

Orbitrap

Najmłodszym w tym zestawieniu jest analizator Orbitrap, chociaż koncepcja znana była już dawno temu, stosunkowo niedawno zyskał on na popularności. Analizator masy typu Orbitrap to niezwykle wydajna konstrukcja zbudowana na zasadzie pułapki jonowej, która daje mu również podwójną funkcjonalność. Jednakże, w przeciwieństwie do liniowej pułapki jonowej łączy w sobie funkcje analizatora masy jak i detektora. Orbitrap składa się z dwóch zewnętrznych elektrod nadających mu beczkowaty wygląd oraz jednej
elektrody wewnętrznej o wrzecionowatym kształcie. Schemat budowy analizatora typu Orbitrap został przedstawiony na Rycinie 4.

Naładowane cząsteczki wprowadzane do Orbitrapa poruszają się wokół elektrody wewnętrznej i pomiędzy dwoma elektrodami zewnętrznymi, jednocześnie przemieszczając się wzdłuż osi. Ruch ten jest indukowany poprzez przyłożenie odpowiedniego potencjału elektrycznego. Jak wspominałem wcześniej Orbitrap jest analizatorem działającym na zasadzie pułapki jonowej, gdyż jony wprowadzone do jego wnętrza są przez pewien czas w nim zatrzymywane. Różne jony oscylują z różnymi częstotliwościami dookoła elektrody wewnętrznej jak i różną częstotliwością wzdłuż analizatora, dzięki czemu uzyskujemy ich rozdział. Mierząc częstotliwość oscylacji jonów wzdłuż analizatora otrzymujemy widma masowe jonów, które są rejestrowane przy zastosowaniu Transformacji Fouriera. Analizator masy Orbitrap ze względu na swoją uniwersalność jest aktualnie powszechnie stosowany w każdego rodzaju analizach z zakresu proteomiki, metabolomiki, lipidomiki czy badaniach biofarmaceutycznych, środowiskowych oraz
toksykologicznych.

Tandemowa Spektrometria Mas

Wracając do dyskusji o idealnym analizatorze masy, a raczej o jego braku, zdecydowano się pójść inną ścieżką i połączyć ze sobą dwa lub więcej analizatorów. Takie rozwiązanie określamy tandemową spektrometrią mas (MS/MS). Analizowane cząsteczki mogą charakteryzować się identyczną lub bardzo zbliżoną masą, z tego też powodu pomiar masy cząsteczkowej nie pozwala na rozróżnienie związków i potencjalną identyfi kację badanej molekuły. Z rozwiązaniem w tym wypadku przychodzi tandemowa spektrometria mas. Połączony układ analizatorów umożliwia kilkukrotną analizę (MSn) masy badanej molekuły. W pierwszym etapie interesujący nas jon ulega odseparowaniu od mieszaniny (MS1), następnie ulega kontrolowanemu rozpadowi na jony fragmentacyjne, które są kolejno analizowane w drugim analizatorze. Tandemowe spektrometry mas są aktualnie bardzo pożądanymi narzędziami w każdym laboratorium analitycznym. Z wykorzystaniem tego typu maszyny można nie tylko z dużą czułością i dokładnością oznaczać zawartość badanych cząsteczek w skomplikowanych mieszaninach ale również na podstawie uzyskanych jonów fragmentacyjnych można wyciągnąć wnioski na temat struktury związku.

Najpowszechniejszym tandemowym spektrometrem mas jest tzw. Triple Quad, czyli spektrometr masowy z potrójnym kwadrupolem (TQMS). Jak sama nazwa wskazuje spektrometr ten jest zbudowany z trzech analizatorów mas typu kwadrupol (QqQ), jednakże tylko dwa z nich (Q1 oraz Q3) są wykorzystywane do filtrowania jonów. Znajdujący się w środku kwadrupol (q2) służy jako celka kolizyjna, w której dochodzi do procesu fragmentacji badanego jonu w obecności gazu obojętnego takiego jak argon, hel lub azot. Urządzenia tego typu są najczęściej wykorzystywane do badań ilościowych związków zawieszonych w skomplikowanych matrycach.
W celu przeprowadzenia analizy takiego związku kluczowa jest znajomość masy cząsteczki badanej oraz przynajmniej masa jednego z jonów fragmentacyjnych powstających w wyniku rozpadu jonu w celce kolizyjnej. W celu przeprowadzenia tego rodzaju analizy wykorzystuje się tryb MRM / PRM (ang. multiple reaction monitoring / paralel reaction monitoring) gdzie po ustawieniu odpowiednich parametrów jesteśmy stanie monitorować stężenie substancji badanej z dużą czułością.

Innym bardzo popularnym przykładem tandemowego spektrometru mas jest QTOF, czyli analizator masy typu kwadrupol sprzężony z analizatorem czasu przelotu jonów. Tego rodzaju instrument w przeciwieństwie do QqQ jest powszechnie używany do analiz jakościowych. W nawiązaniu do poprzedniego akapitu instrument QTOF można opisać najprościej jako spektrometr masowy o budowie potrójnego kwadrupola, gdzie ostatni kwadrupol został zastąpiony analizatorem czasu przelotu (TOF). Wspomniany spektrometr masowy jest powszechnie używany w badaniach profi lowania zarówno białkowego jak i metabolomicznego, w analizach mających na celu wykrycie i oznaczenie potencjalnych zanieczyszczeń produktów leczniczych oraz w badaniach strukturalnych.

Powszechnie wykorzystywanym rozwiązaniem w badaniach proteomicznych jest połączenie kwadrupola z orbitrapem, który łączy sobie w funkcję analizatora masy jak i detektora. Kwadrupol w tym zestawieniu służy jako filtr masy, gdzie następuje wstępna selekcja jonów i dalsza transmisja. Jony trafi ają następnie do celki kolizyjnej gdzie zachodzi ich fragmentacja, a uzyskane fragmenty trafiają do orbitrapa gdzie zachodzi ich analiza.

Który analizator masy wybrać?

Jak wspominałem na samym początku wybór odpowiedniego analizatora zależy od tego co chcielibyśmy na nim robić. Nie ma uniwersalnych rozwiązań i nie jesteśmy w stanie jednym urządzeniem zastąpić wszystkie inne. Jeśli zapytamy sprzedawców to każdy przedstawiciel handlowy powie nam, że taką analizę da się przeprowadzić na danym spektrometrze. Prawdopodobnie znajdzie również odpowiednią notkę aplikacyjną do danego badania. Pamiętajmy jednak, że analityka wiąże się z rzetelnością i zawsze powinniśmy się starać przeprowadzić badanie najlepiej jak jest to możliwe i z wykorzystaniem sprzętu, który do takich badań został stworzony.

W ostatnim rozdziale tego artykułu chciałbym przedstawić tabelaryczne (Tabela 1) zestawienie dla różnych analizatorów masy, które podsumuje to o czym wcześniej pisałem oraz da możliwość porównania różnego rodzaju analizatorów wymienionych w tym artykule.

Na koniec tego rozdziału chciałbym abyście zapamiętali jedno: wybór analizatora masy powinien być stricte oparty na aplikacji do jakiej będzie wykorzystywany, pożądanej wydajności, a najmniej kluczowym aspektem powinna być jego cena. Wiem jednakże jak ciężko będzie do tego przekonać osoby, które wykładają na ten sprzęt pieniądze…

Bibliografia:

1. Syed S.; Maher S.; Taylor S. (2013). "Quadrupole mass fi lter operation under the influence of magnetic fi eld". Journal of Mass Spectrometry. 48 (12): 1325–1339.
2. Glish, G.; Scott A. McLuckey; Ridley, T; Cooks, R (1982). "A new "hybrid" sector/quadrupole mass spectrometer for mass spectrometry/mass spectrometry". International Journal of Mass Spectrometry and Ion Physics. 41.
3. Brown, R. S.; Lennon, J. J. (1995). "Mass resolution improvement by incorporation of pulsed ion extraction in a matrix-assisted laser desorption/ionization linear time-of-flight mass spectrometer". Anal. Chem. 67 (13): 1998–2003.
4. Vestal ML, Campbell JM (2005). "Tandem Time-of-Flight Mass Spectrometry". Tandem time-of-fl ight mass spectrometry. Meth. Enzymol. Methods in Enzymology. 402. pp. 79–108.
5. Makarov, A (2000). "Electrostatic axially harmonic orbital trapping: A high-performance technique of mass analysis". Analytical Chemistry. 72 (6): 1156–62.
6. Makarov, A; Denisov, E; Kholomeev, A; Balschun, W; Lange, O; Strupat, K; Horning, S (2006). "Performance evaluation of a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer". Anal. Chem. 78 (7): 2113–20.

Dr Michał Górka
Lider Zespołu ADMET / Bioanalizy
Celon Pharma S.A

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Farmaceutycznego" 1/2021