Preparaty probiotyczne – wyzwaniem dla laboratoriów mikrobiologicznych

Liczba dostępnych komercyjnie produktów probiotycznych stale się zwiększa. Większość z nich posiada status suplementów diety, a niewielki odsetek – produktów leczniczych.

Kolonizacja przewodu pokarmowego specyficzną dla każdego człowieka populacją mikroorganizmów odbywa się już w pierwszych dniach życia człowieka. Jej największe zmiany zachodzą przed zakończeniem karmienia piersią, a potem dopiero w wieku podeszłym. Właściwie zrównoważona mikroflora odpowiada za prawidłowy przebieg procesu trawienia oraz stanowi swoistą ochronę organizmu przed bakteriami chorobotwórczymi.

Flora przewodu pokarmowego człowieka często może ulegać zaburzeniom spowodowanym kuracją antybiotykową, zabiegami chirurgicznymi, infekcjami, niewłaściwą dietą, zmianami pożywienia (szczególnie w podróżach), stresem, siedzącym trybem życia i wiekiem. W celu przywrócenia naturalnej mikroflory przewodu pokarmowego zaleca się stosowanie preparatów, w których skład wchodzą bakterie kwasu mlekowego, głównie z rodzajów: Lactobacillus (Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. plantarum, Lb. casei), Bifidobacterium (Bif. bifidum) i Lactococcus (Lc. lactis).

Badanie czystości mikrobiologicznej preparatów farmaceutycznych zawierających bakterie kwasu mlekowego

Producenci mają obowiązek przed zwolnieniem produktu na rynek wykonać szereg badań, które potwierdzą bezpieczeństwo danego produktu. Jednym z takich oznaczeń jest badanie czystości mikrobiologicznej.

Polega ono na ocenie, czy produkt nie zawiera oprócz wprowadzonych drobnoustrojów probiotycznych flory towarzyszącej, patogennej, która mogłaby stanowić zagrożenie dla zdrowia konsumentów.

Wraz z wejściem w życie suplementu 9.7 do Ph. Eur. 9.0 na laboratoria mikrobiologiczne został nałożony obowiązek doboru metody badania preparatów zawierających w swym składzie LAB, czyli uzyskania wzrostu bakterii wskaźnikowych w obecności bakterii mlekowych. Jak się okazuje w praktyce, otrzymanie odpowiedniego odzysku drobnoustrojów testowych dodanych do preparatu zawierającego miliardy bakterii kwasu mlekowego jest bardzo trudne, a czasami nawet niemożliwe.

Ogólne zasady doboru metody dla tych produktów nie różnią się od tych opisanych dla pozostałych produktów farmaceutycznych:

• jeśli składniki inne niż substancja czynna LAB posiadają aktywność hamującą, należy ją w miarę możliwości zneutralizować, wykazując skuteczność tej neutralizacji oraz brak toksyczności użytego neutralizatora na drobnoustroje zanieczyszczające,
• akceptowalny wynik liczenia każdego z drobnoustrojów nie może być więcej niż 2 razy mniejszy/większy od wartości otrzymanej dla kontroli bez LAB,
• drobnoustroje stosowane do badania nie mogą pochodzić z wyższego niż 5 pasażu macierzystej serii siewnej,
• należy badać żyzność stosowanych podłóż.

Farmakopea w ryc. 2.6.36-1 oraz 2.6.38-1 podaje schematy decyzyjne ułatwiające postepowanie w procesie doboru metody badania oraz modyfikacje, które można zastosować w trakcie badania, a które mają na celu zwiększenie szans na uzyskanie odpowiedniego odzysku drobnoustrojów testowych:

• zwiększenie ilości rozcieńczalnika,
• dodanie związku powierzchniowo czynnego,
• modyfikacje temperatury – bakterie termofilne osiągają optimum wzrostu przy 37-45°C. Przykładami są tu niektóre gatunki z rodzaju Lactobacillus (L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. plantarum, L. casei), a także Streptococcus thermophilus., natomiast mezofilne rosną najlepiej w temperaturach od 20 do 28°C. Należą do nich Lactococcus lactis ssp. cremoris oraz L. lactis ssp. lactis,
• modyfikacje pH – bakterie kwasu mlekowego posiadają zdolność do regulacji wewnątrzkomórkowego pH, co umożliwia im przetrwanie w środowisku kwaśnym, z którego bardzo często są izolowane. Przykładami potwierdzającymi to zjawisko są L. debrueckii subsp. bulgaricus oraz L. helvetius. Wykazują one najszybszy wzrost przy pH 5,5-5,8. Istnieje jednak wiele gatunków zaklasyfikowanych do neutrofili, takich jak L. lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. lactis (pH 6,3- 6,9) oraz S. termophilus (pH 6,5-7,5),
• użycie innych podłoży mikrobiologicznych – dla bakterii mlekowych odpowiednie są podłoża bogate w trypton, ekstrakt drożdżowy oraz laktozę, ewentualnie glukozę przy hodowli szczepów niefermentujących laktozy.

Mimo zastosowania szeregu modyfikacji podłóż, temperatury i pH, bardzo często nie udaję się osiągnąć wymaganego odzysku drobnoustrojów, a nawet obserwuje się całkowite zahamowanie ich wzrostu. Z pozoru łatwe doświadczenia w ramach doboru metody badania dla preparatów zawierających żywe mikroorganizmy stały się dla laboratoriów prawdziwym wyzwaniem na marę pracy badawczej. Pochłaniają bardzo dużo czasu oraz zasobów finansowych czy personalnych. Wymagają dużej wiedzy na temat zapotrzebowania tych mikroorganizmów m.in. na substancje odżywcze, warunki środowiskowe, aby odpowiednio zaplanować modyfikacje. Te wszystkie utrudnienia sprawiają, że laboratoria komercyjne wykonujące na co dzień wiele różnorodnych badań są zmuszone do rezygnacji z tego typu zleceń.

Alternatywą dla tradycyjnych metod mikrobiologicznych powoli stają się badania z użyciem technik biologii molekularnej, np. Real Time PCR, które są prostymi i szybkimi testami jakościowymi polegającymi na wykryciu charakterystycznych sekwencji DNA obecnych w badanej próbce, czy coraz bardziej popularna w przemyśle cytometria przepływowa, która polega na detekcji komórek przechodzących przez strumień światła laserowego. W celu zróżnicowania dokonuje się znakowania fluorescencyjnego komórek, co daje możliwość równoczesnego wykrycia różnych organizmów bądź też komórek tego samego organizmu w różnych fazach rozwojowych.

Bakteriocyny i inne metabolity produkowane przez bakterie mlekowe

Jednym z powodów trudności w doborze metody badania mogą być zdolności bakterii probiotycznych do antagonizmu w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, w tym bakterii patogennych. Mechanizm tego procesu polega na współzawodnictwie o substancje odżywcze oraz produkcji substancji, takich jak kwas mlekowy, octowy, nadtlenek wodoru i bakteriocyny wywołujących tzw. niespecyficzną inhibicję rozwoju patogenów.

Bakteriocyny to syntetyzowane, rybosomalnie substancje o charakterze peptydowym, które hamują wzrost blisko spokrewnionych gatunków drobnoustrojów przez liczne mechanizmy działania. Posiadają najczęściej stosunkowo wąskie spektrum aktywności antymikrobiologicznej. Najskuteczniej działają względem mikroorganizmów blisko spokrewnionych z wytwarzającymi je producentami. Bakteriocyny mogą działać bakteriostatycznie bądź bakteriobójczo, najczęściej atakując błonę komórkową mikroorganizmów i zakłócając wewnętrzny metabolizm ich komórek. Większość bakteriocyn wykazuje bakteriobójcze działanie na wrażliwe mikroorganizmy, powodując gwałtowne zmniejszenie populacji bakterii nawet w ciągu kilku minut od chwili kontaktu.

Pozostałe metabolity produkowane przez bakterie mlekowe to:

• kwas mlekowy, octowy i propionowy – najsilniejszymi właściwościami hamującymi rozwój drobnoustrojów charakteryzuje się kwas octowy. Skutecznie hamuje on wzrost bakterii, pleśni i drożdży. Działanie kwasów organicznych w znacznym stopniu polega na obniżaniu pH środowiska do poziomu niekorzystnego dla patogenów, a także na zaburzaniu procesów metabolicznych zachodzących
w komórkach drobnoustrojów oraz transportu aktywnego przez błony komórkowe,
• diacetyl – lotny, niepolarny diketon powstający z rozkładu pirogronianu. Wykazuje właściwości bakteriobójcze względem niektórych Gram-ujemnych bakterii poprzez inaktywację szlaku metabolicznego argininy. Dowiedziono, że podczas równoczesnego działania z nizyną skutecznie hamuje wzrost Listeria monocytogenes,
• nadtlenek wodoru – posiada silne właściwości antymikrobiologiczne, polegające na denaturacji enzymów komórkowych i peroksydacji lipidów błonowych, które prowadzą do zaburzenia czynności błon komórkowych oraz zatrzymania wielu szlaków metabolicznych,
• dwutlenek węgla – jeden z produktów ubocznych heterofermentacji mlekowej. Powstaje również w trakcie innych przemian metabolicznych bakterii. Wykazuje działanie bakteriobójcze, szczególnie przeciwko bakteriom Gram-ujemnym.

Bakterie kwasu mlekowego produkują szeroką gamę metabolitów bezpiecznych dla zdrowia konsumenta, które stanowią skuteczną broń w walce z florą patogenną.

Podsumowanie

Większość badań wykonywanych obecnie w laboratoriach mikrobiologicznych opiera się na starych metodach opracowanych przez mikrobiologów pionierów, czyli Pasteura, Kocha i Listera. Polegają one na odzysku i wzroście mikroorganizmów z wykorzystaniem stałych lub płynnych podłoży mikrobiologicznych. Są to proste i niezbyt drogie metody, które od dawna stosowane są w kontroli mikrobiologicznej w przemyśle i nadal dobrze służą mikrobiologom zarówno do oceny ilości, jak i identyfikacji drobnoustrojów. Jednak to, co sprawdza się w przypadku badania, np. preparatów farmaceutycznych niesterylnych, nie zawsze ma zastosowanie przy ocenie czystości mikrobiologicznej preparatów, w których skład wchodzą żywe drobnoustroje.

Liczba bakterii probiotycznych, z jaką spotykamy się w produktach leczniczych czy suplementach diety, sięga miliardów jednostek tworzących kolonię na dawkę. Skład takich preparatów jest bogaty i często nie kończy się tylko na kombinacji jednego czy dwóch szczepów probiotycznych – jest mieszaniną kilkunastu drobnoustrojów, a co za tym idzie bardziej zróżnicowanego wachlarza produkowanych przez nie substancji antybakteryjnych. Uzyskanie w takich warunkach wzrostu bakterii testowych, których dodajemy maksymalnie 100 jednostek tworzących kolonię na ml, jest często niemożliwe.

Problemy z doborem metody badania zgodnie aktualnymi dokumentami odniesienia wykluczają często z rynku małe laboratoria, dla których wdrożenie skutecznych metod okazało się zbyt kosztowną inwestycją. Rynek preparatów probiotycznych to nadal w większości suplementy diety, których te wymagania nie dotyczą, więc odsetek produktów do badania nadal jest niewielki.

Najnowsze wymagania co do badań produktów zawierających żywe drobnoustroje stały się ogromnym wyzwaniem dla laboratoriów, ale jednocześnie dają gwarancję, że badany preparat jest wolny od zanieczyszczeń zagrażających zdrowiu konsumentów.

Piśmiennictwo

1. Problemy stosowania suplementów diety zawierających probiotyki. Problems with use of dietary supplements containing probiotics, Anna Lutyńska, Ewa Augustynowicz, Aldona Wiatrzyk, Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego – Państwowy Zakład Higieny w Warszawie.
2. Probiotyki, prebiotyki i synbiotyki – charakterystyka i funkcje. Probiotics, prebiotics and synbiotics – characteristics and functions, Katarzyna Mojka, Katedra Technologii Żywności, Wydział Nauk o Żywności i Rybactwa, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny w Szczecinie.
3. Bakteriocyny bakterii fermentacji mlekowej jako alternatywa antybiotyków. Bacteriocins from lactic acid bacteria as an alternative to antibiotics, Aleksandra Ołdak, Dorota Zielińska, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie, Wydział Nauk o Żywieniu Człowieka i Konsumpcji, Katedra Technologii Gastronomicznej i Higieny Żywności.
4. Kamila Goderska, Tomasz Rychlik, Ewa Andrzejewska, Andrzej Szkaradkiewicz, Zbigniew Czarnecki, Antagonistyczny wpływ Lactobacillus Acidophilus DSM 20079 i DSM 20242 na bakterie patogenne, izolowane od ludzi.
5. Bakteriocyny – właściwości i aktywność przeciwdrobnoustrojowa, Daniela Gwiazdowska, Krystyna Trojanowska Katedra Biochemii i Mikrobiologii, Akademia Ekonomiczna, Poznań, 2 Katedra Biotechnologii i Mikrobiologii Żywności, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego, Poznań.
6. Metabolity bakterii kwasu mlekowego i ich zastosowanie w przemyśle, Katarzyna Ratajczak, Agnieszka Piotrowska-Cyplik, Zakład Fermentacji i Biosyntezy, Instytut Technologii Żywności Pochodzenia Roślinnego, Wydział Nauk o Żywności i Żywieniu, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu.
7. Cytometria przepływowa w analizie żywności, Alina Kunicka-Styczyńska, Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej.
8. Farmakopealne metody badań, Jadwiga Marczewska, Krystyna Mysłowska, LAB 2019, nr 2.
9. Suplement 9.7 do Ph. Eur. 9.0.

mgr inż. Magdalena Ziętal
Laboratorium Mikrobiologiczne
BIO-CHIC Sp. z o.o.

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Farmaceutycznego" 1/2021