Charakterystyka wzorców zanieczyszczeń. Jaka jakość jest wystarczająco dobra?

Zanieczyszczenia w substancjach leczniczych i produktach leczniczych muszą być utrzymywane pod kontrolą, na poziomie gwarantującym jakość produktu. Dlatego też wytyczne Międzynarodowej Konferencji ds. Harmonizacji (ICH) nr Q3A i Q3B wskazują oczekiwania organów regulacyjnych w zakresie badania i kontroli zanieczyszczeń. Tabela 1 zawiera ogólne informacje o progach wykazywania, identyfikacji oraz kwalifikacji zanieczyszczeń w farmaceutycznych substancjach czynnych.

W przypadku przekroczenia progu kwalifi kacji najlepszy scenariusz polega na tym, że w literaturze dostępne są dane o bezpieczeństwie, w najgorszym – dane muszą zostać uzyskane poprzez czasochłonne i kosztowne badania toksyczności. Zasady ICH powinny być przestrzegane również w przypadku produktów generycznych. Wytyczne na ten temat zostały wydane przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA)[1] oraz europejskie organy regulacyjne[2]. Monografie zawarte w Farmakopei Amerykańskiej (USP) i Farmakopei Europejskiej (Ph.Eur.) zostały dostosowane do/są dostosowywane do wymagań ICH. Dlatego też niezbędna jest dokładna ocena poziomów zanieczyszczeń w fazie badań i rozwoju (R&D) projektów dotyczących API i/lub FDF, a także na późniejszych etapach cyklu życia produktów farmaceutycznych.

W fazie badań i rozwoju nowych (generycznych) API oraz FDF w celu wykrywania, identyfi kacji i oznaczania ilościowego zanieczyszczeń powszechnie stosowane są metody HPLC z wykorzystaniem detekcji MS i UV. Do celów rutynowej kontroli jakości opracowywane i poddawane walidacji są metody HPLC z detekcją UV. Na wszystkich tych etapach analitycznych ważną rolę odgrywają wzorce zanieczyszczeń, co rodzi pytanie, jak powinny być one scharakteryzowane.

W przypadku pierwszorzędowych wzorców API jest wiele sugestii, np. w rozdziale 5.12 Farmakopei Europejskiej (Ph.Eur.) dotyczącym wymagań ogólnych. Również wytyczna ICH Q7 odnosi się do wzorców porównawczych dla API[3].

Jednak w przypadku wzorców zanieczyszczeń informacje oraz wskazówki są trudniej dostępne i mniej szczegółowe. Brakuje jednoznacznych wspólnych wymogów dotyczących wzorców zanieczyszczeń, więc nie dziwi fakt, że podejście do tych wzorców – prezentowane zarówno przez ich producentów, jak i użytkowników końcowych – bywa bardzo zróżnicowane.

Omówienie

Głównym czynnikiem, który powinien determinować zakres charakterystyki analitycznej wzorca zanieczyszczeń, jest jego zamierzone zastosowanie analityczne. Istnieją dwa główne rodzaje zastosowań analitycznych: jakościowe i ilościowe (Tabela 2).

Charakterystyka wzorców zanieczyszczeń do zastosowań jakościowych

Najważniejszą kwesti ą jest oczywiście upewnienie się, że tożsamość materiału będącego potencjalnym wzorcem zanieczyszczenia jest dokładnie taka, jaka być powinna w odniesieniu do części organicznej. W przypadku metod HPLC nie jest konieczne posiadanie informacji na temat postaci soli (tj. przeciwjonów soli). O tym, w jakiej postaci część organiczna przechodzi przez kolumnę HPLC i jest widoczna dla detektora, decydują zazwyczaj rozpuszczalnik i faza ruchoma, a więc czas retencji, widma ultrafioletowe i masowe powinny być porównywalne między wzorcem zanieczyszczenia a pikiem próbki niezależnie od postaci soli obecnych we wzorcu zanieczyszczenia. Możliwy wpływ postaci soli na pH i związane z tym zmiany czasów retencji są zwykle niwelowane przez zastosowanie odpowiednich układów buforowych dla fazy ruchomej.

Ważne jest potwierdzenie tożsamości wzorca zanieczyszczenia wieloma technikami (por. też rozdział 5.12 Ph.Eur.) z użyciem racjonalnej kombinacji metod. W większości przypadków magnetyczny rezonans jądrowy (w szczególności 1H-NMR), spektroskopia w podczerwieni (IR) i dane dotyczące spektroskopii mas (MS), zazwyczaj uzyskane metodami HPLC lub chromatografii gazowej (GC), powinny dostarczyć wystarczających informacji na temat struktury chemicznej materiału będącego potencjalnym wzorcem zanieczyszczenia. Jeżeli zanieczyszczenie jest określone jako enancjomer, należy oznaczyć jego czystość enancjomeryczną, jeżeli ma ono być stosowane do analizy ilościowej związków chiralnych.

Ponadto w określeniu składu chemicznego i wskazaniu możliwych postaci soli może zostać wykorzystana analiza elementarna (CHN).

Podczas interpretacji danych dotyczących tożsamości żaden sygnał ani wynik nie powinien być sprzeczny z zakładaną strukturą chemiczną wzorca zanieczyszczenia. Jeżeli pojawią się sprzeczności, niezbędne jest ich rozstrzygnięcie przed wprowadzeniem potencjalnego wzorca do użytku. Zaleca się również dążenie do osiągnięcia minimalnej czystości na poziomie 85 proc. (w przeciwnym razie interpretacja danych NMR i IR może stać się trudna).

Charakterystyka wzorców zanieczyszczeń do zastosowań ilościowych

Oczywiście, podobnie jak w przypadku zastosowań jakościowych, należy uzyskać pewność co do tożsamości materiału, dlatego też wszystkie powyższe uwagi odnoszą się również do wzorców ilościowych. W przypadku zastosowań ilościowych zdecydowanie zaleca się jednak przeprowadzenie analizy CHN w celu ustalenia, czy potencjalny wzorzec zanieczyszczenia występuje w postaci soli. Możliwe jest również wykorzystanie alternatywnej metody do określenia postaci soli. Jednak w celu ilościowego zastosowania wzorca zanieczyszczenia niezbędna jest weryfikacja postaci soli. Czystość chromatograficzna może być wysoka zarówno w przypadku wolnej zasady/kwasu, jak i soli danego materiału, ale mogą występować drastyczne różnice w wyniku oznaczenia zawartości substancji organicznej. Wiadomo o przypadkach, w których skutkowało to problemami. W niedawnej przeszłości dochodziło nawet do wycofania wzorców farmakopealnych w związku z tą kwestią.

Głównym wymogiem przy ocenie wzorca zanieczyszczenia jest czystość organiczna. Czystość powinna być jak najwyższa, gdyż metoda 100 proc. opiera się na ustaleniu wszystkich zanieczyszczeń w danym zanieczyszczeniu. Im czystszy jest związek, tym mniejszy jest błąd ustalenia zawartości tych zanieczyszczeń i tym dokładniejszy[4] j est wynik o znaczenia zawartości w odniesieniu do wzorca zanieczyszczenia. Czystość organiczna jest w niemal wszystkich przypadkach określana metodami chromatograficznymi, głównie HPLC[5].

Czystość organiczna nie jest równa ostatecznemu wynikowi oznaczenia zawartości we wzorcu zanieczyszczenia. Należy ustalić także np. ilość wody i pozostałości rozpuszczalników, po czym odjąć je od 100 proc.

Wskazania dotyczące zanieczyszczeń nieorganicznych mogą zostać uzyskane, a następnie dokładniej zbadane przy użyciu analizy CHN. Alternatywnie danych uzupełniających może dostarczyć oznaczenie pozostałości po prażeniu (ROI)[6], ale jest to technika rzadko stosowana w charakterystyce wzorców zanieczyszczeń, gdyż wymaga ona zużycia dużych ilości cennego potencjalnego wzorca zanieczyszczenia. W razie potrzeby do ilościowego oznaczenia zanieczyszczeń nieorganicznych można zastosować techniki takie, jak chromatografia jonowa.

W przypadku nieobecność zanieczyszczeń nieorganicznych ostateczny wynik oznaczenia zawartości można obliczyć przy użyciu następującego równania:

wynik oznaczenia zawartości (%)
= (100% – składniki lotne) x czystość (%)/100%

Do składników lotnych należy zarówno woda, jak i pozostałości rozpuszczalników. Są one określane jako wkład bezwzględny, podczas gdy czystość jest uznawana za wkład względny.

Kontrola zgodności danych

Podczas produkcji wzorców zanieczyszczeń często istnieje możliwość potwierdzenia niektórych danych z użyciem informacjiuzyskanych z innych badań. Na przykład rysunek 1 przedstawia chromatogram HPLC i wynik badania 1H-NMR wzorca zanieczyszczenia kwasu 4-chlorobenzoesowego (zanieczyszczenia bezafibratu). W HPLC można zaobserwować bardzo niewielkie ślady pochodnej hydroksylowej. Badanie NMR dowodzi obecności pochodnej hydroksylowej w dokładnie takich samych ilościach śladowych, co potwierdza, że w wyniku użycia metody HPLC czystość określono prawidłowo. Ogólnie można stwierdzić, że jeżeli producent wzorca zanieczyszczenia dysponuje odpowiednim doświadczeniem, potwierdzenie zgodności wyników z użyciem ortogonalnych metod stanowi potężne narzędzie zapewniające prawidłowe ustalenie tożsamości i oznaczenie zawartości.

Wykorzystanie jakościowych wzorców zanieczyszczeń do celów ilościowych

W przeciwieństwie do wzorców API w przypadku niektórych zastosowań ilościowych możliwe jest wykorzystanie jakościowych wzorców zanieczyszczeń z zastrzeżeniami podanymi poniżej[7]. Wynika to z faktu, że w normalnych warunkach jakościowy wzorzec zanieczyszczenia, w przypadku którego zakładamy czystość na poziomie 100 proc., skutkuje przeszacowaniem zanieczyszczenia API i FDF. Wytyczne ICH dopuszczają zastosowanie procedur skutkujących przeszacowaniem zanieczyszczeń, gdyż nie pociąga to za sobą obaw o bezpieczeństwo lub jakość leku podawanego pacjentom. Użytkownicy wzorców jakościowych mogą jednak natknąć się na problemy natury ekonomicznej i związane z walidacją.

Użytkownik jakościowego wzorca zanieczyszczenia powinien wziąć pod uwagę następujące zastrzeżenia:

• Należy zawsze przyjmować, że czystość jakościowych wzorców zanieczyszczeń wynosi 100 proc. Korzystanie z oświadczenia, takiego jak np. „czystość > 80 proc.”, jako wyniku oznaczenia zawartości do celów obliczeniowych nie jest podejściem prawidłowym[8]. Rzeczywista zawartość jest zazwyczaj wyższa, a niedoszacowanie zanieczyszczenia podczas analizy próbek nie może być tolerowane w żadnym środowisku regulowanym GMP.
• Możliwe są problemy w trakcie badań walidacyjnych. Zastosowanie w niewystarczającym stopniu scharakteryzowanego wzorca zanieczyszczenia podczas walidacji dokładności metody badania zanieczyszczeń (z wykorzystaniem wskaźników odzysku) może skutkować nieświadomym dokonaniem walidacji poza właściwym zakresem[9].
• Przeszacowanie wiąże się z ryzykiem ekonomicznym. Przeszacowanie może skutkować fałszywymi wynikami poza specyfikacją (out-of-specification, OOS), co skutkuje niepotrzebnymi i czasochłonnymi dochodzeniami. Ryzyko wyników poza specyfikacją rośnie, gdy zmienia się seria wzorca zanieczyszczeń. Badanie wyników OOS jest uważane za kosztowne: koszty mogą łatwo urosnąć do kilkudziesięciu tysięcy dolarów dziennie w zależności od liczby osób pracujących nad problemem. Ostatecznie jeżeli problem OOS nie zostanie we właściwy sposób rozwiązany, może dojść do utraty całej serii produkcyjnej, co dodatkowo zwiększa koszty[10].

Podczas fazy badawczo-rozwojowej związanej z nowymi projektami API/FDF przeszacowanie może prowadzić do przekroczenia progów kwalifikacji podanych w wytycznych Q3A/B ICH, a to z kolei skutkuje często długotrwałymi i kosztownymi badaniami toksyczności. W Q3A/B wspomina się o badaniach o czasie trwania do 90 dni. Kolejny miesiąc niezbędny na ocenę danych po badaniu oznacza, że badania takie mogą w niektórych przypadkach opóźnić czas wprowadzenia produktu do obrotu o cztery miesiące.

Koszty ponoszone w wyniku dochodzeń związanych z wynikami poza specyfikacją i badań toksyczności są niewątpliwie wielokrotnie wyższe od kosztów inwestycji w ilościowy wzorzec zanieczyszczenia.

Należy zauważyć, że im mniejszą ilością informacji analitycznych dysponujemy, tym większe jest ryzyko ekonomiczne. W zależności od źródła często może brakować prawidłowego określenia tożsamości wzorców w odniesieniu do postaci soli. Często nie jest również sprawdzana zawartość wody i pozostałości rozpuszczalników. W szczególności woda zawarta w hydratach może stanowić znaczny procent materiału będącego potencjalnym wzorcem. Problemy związane z postacią soli i zawartością wody mogą łatwo prowadzić do błędów przeszacowania przekraczających 40 proc., tzn. zakładany jest wynik oznaczenia zawartości na poziomie 100 proc., podczas gdy w rzeczywistości wynosi on jedynie 70 proc., nawet jeżeli czystość chromatograficzna jest dosyć wysoka.

Wnioski

Identyfikacja i oznaczanie ilościowe zanieczyszczeń w produktach leczniczych stanowią ważne etapy w cyklu życia API oraz form gotowych leku (FDF). Wzorce zanieczyszczeń są ważnym narzędziem identyfikacji/oznaczenia ilościowego zanieczyszczeń.

Jeżeli chodzi o charakterystykę wzorców zanieczyszczeń, o minimalnym nakładzie pracy analitycznej niezbędnym w celu zapewnienia odpowiedniego wzorca decyduje jego zamierzone zastosowanie. W przypadku jakościowych wzorców zanieczyszczeń wymaganych jest mniej badań analitycznych niż w przypadku wzorców stosowanych do celów ilościowych. W tym drugim przypadku niezbędne jest uzyskanie dokładnego wyniku oznaczenia zawartości, dlatego niezbędna jest wiedza, czy potencjalny wzorzec występuje w postaci soli danej substancji organicznej, czy też wolnej zasady/kwasu. Ponadto oprócz czystości organicznej należy też ustalić zawartość wody i pozostałości rozpuszczalników, aby uzyskać dokładne oznaczenie zawartości metodą bilansu masy.

Jakościowe wzorce zanieczyszczeń mogą też być stosowane – pod pewnymi warunkami – do celów ilościowych. Podejście to skutkuje jednak przeszacowaniem zanieczyszczeń API i FDF, co może z dużym prawdopodobieństwem wygenerować dodatkowe koszty, które będą o kilka rzędów wielkości wyższe od kosztu ilościowego wzorca zanieczyszczenia. Z kolei właściwie scharakteryzowany ilościowy wzorzec, w miarę możliwości wytworzony zgodnie z wymogami wyspecjalizowanego systemu zapewnienia jakości (tj. ISO 17034:2016), nadaje się do wszystkich zastosowań.

Bibliografia

Niniejszy artykuł jest oparty na publikacji Mikromol „Charakterystyka niefarmakopealnych wzorców zanieczyszczeń: jaka jakość jest wystarczająco dobra?”, autorstwa dr. Bernarda Olsena i dr. Christiana Zeine’a.

[1] FDA Guidances for Industry, ANDAs: Impurities in Drug Substances/Products, https://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/UCM172002.pdf, https://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm072861.pdf, [dostęp: 13 marca 2018 r.].
[2] Wytyczne EMA CPMP/QWP/1529/04, http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002924.pdf, [dostęp: 13 marca 2018 r.].
[3] ICH Q7, glosariusz.
[4] Dokładność (accuracy) jest czasem nazywana poprawnością (trueness) (zob. też Q2(R1)).
[5] Dlatego też czystość organiczna i chromatograficzna są często używane jako synonimy.
[6] W Europie technika pozostałości po prażeniu jest częściej określana jako technika oznaczenia zawartości popiołu siarczanowego.
[7] Jakościowego wzorca zanieczyszczenia nie należy mylić z substancją chemiczną przeznaczoną do badań naukowych. Z formalnego punktu widzenia można również wykorzystywać materiały badawcze, lecz jakościowy wzorzec zanieczyszczenia ustanowiony w ramach wyspecjalizowanego systemu zapewnienia jakości został zazwyczaj poddany dokładniejszemu badaniu tożsamości, a także jest monitorowany pod kątem ciągłej przydatności do użytku (tj. są prowadzone badania stabilności).
[8] Ankieta przeprowadzona podczas internetowego seminarium LGC wykazała, że tylko 16 proc. respondentów (7 spośród 44) rozumiało, dlaczego obliczenia należy prowadzić przy założeniu 100 proc. czystości.
[9] Przykład: Wzorzec porównawczy cechuje się wynikiem oznaczenia zawartości analitu 70 proc. zamiast 100 proc. i jest stosowany w metodzie opartej na wskaźniku odzysku (doświadczenia ze wzbogacaniem próbek). Wówczas w przypadku specyfikacji zanieczyszczeń brzmiącej „nie więcej niż 0,15 proc.” walidacja nie odbywa się w zalecanym zakresie 0,05-0,18 proc., lecz jedynie w zakresie 0,04-0,13 proc. Wartość 0,13 proc. znajduje się poniżej specyfikacji „nie więcej niż 0,15 proc.”.
[10] How painful are OOS investigations?, http://complectors.com/?p=64, [dostęp: 9 marca 2018 r.].

Dr. Sabrina Kusserow
Global Product Manager Pharmaceuti cals
LGC Standards | LGC GmbH

Artykuł został opublikowany w kwartalniku "Świat Przemysłu Farmaceutycznego" 1/2020